交叉引物恒溫擴增技術檢測創傷弧菌的應用研究

張 晶,吳新偉,陳惠玲,陳佳璇,狄 飚,白志軍

創傷弧菌(Vibriovulnificus)隸屬弧菌科弧菌屬，廣泛分布于亞熱帶河口、海洋及海產品中，是一種重要的海洋病原體[1-2]。相比霍亂弧菌、副溶血性弧菌，創傷弧菌容易在有潛在慢性疾病或免疫力低下的易感人群中造成嚴重的致命的感染[3]。在美國，澳大利亞，加拿大，西班牙，日本，韓國，中國臺灣和我國浙江有許多該病原體引起的的死亡病例[3-6]。防控創傷弧菌危害發生的關鍵是快速檢測和早期及時診斷。近幾年發展起來的交叉引物恒溫擴增(cross priming amplification，CPA) 技術是一種新興核酸等溫擴增技術[7]，具有恒溫、快速等特點，應用前景廣泛。本研究擬針對創傷弧菌特異性溶血素A基因(Vibrio vulnificus specific hemolysin gene A，vvhA)設計特異性引物和探針，利用CPA結合膠體金免疫層析技術和全封閉式核酸檢驗裝置，建立一種快速準確的檢測創傷弧菌的新方法。

1 材料與方法

1.1菌株來源 試驗用創傷弧菌菌株為本實驗室自海產品中分離保存。其他菌株：溶藻弧菌、河弧菌、霍亂弧菌、蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌核酸、銅綠假單胞菌和胎兒彎曲桿菌菌株均由本實驗室保存。創傷弧菌vvhA基因攜帶情況均經熒光PCR法驗證。

1．2儀器與試劑 恒溫金屬浴(杭州博日科技有限公司)，熒光定量PCR儀(美國ABI)。Bst DNA polymerase(美國NEB)，DNA核酸提取試劑盒(德國Qiagen)，含有核酸試紙條的全封閉式核酸檢測裝置(杭州尤思達生物技術有限公司)，創傷弧菌熒光PCR試劑盒(深圳生科原生物科技有限公司)。引物和探針委托TaKaRa公司合成。

1．3 方 法

1．3．1引物和探針設計 通過序列比對vvhA基因(GenBank: KP224270.1)的保守區域，設計CPA引物和探針。包括1對外圍引物VVF3和VVB3，1對交叉擴增引物VVDR1和VVCPF，以及1對檢測探針VVDR5F(5′端標記熒光素FitC)和VVDF5B ( 5′端標記生物素Biotin)，見表1。

表1 CPA引物和探針序列
Tab.1 CPA primers and the sequences of probes

引物和探針序列(5′-3′)VVF3CGGCAACGTCAGATGGTTVVB3CGGGTTTCACCCAAAGGTVVDR1AACCAGCTGTATCTTGCTGVVCPFATGAATACCCGTGCCAGGCTTTCCT-GACGCCAAAATTGTCCVVDR5FFITC- GTCGGCATCGACGGTGAAACVVDF5BBIOTIN- ATGAATACCCGTGCCAGGCT

1．3．2基因組DNA的制備 采用腦心浸液培養基于恒溫培養搖床中37 ℃，150 r/min培養24 h。用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，-20 ℃保存備用。

1．3．3優化CPA反應體系 CPA反應體積20 μL，通過改變反應溫度，調整引物探針濃度以及優化Bst DNA polymerase、Betaine、MgSO4、dNTPs劑量反應體系，最終利用分析試紙條的檢測結果確定最佳CPA反應體系。

1．3．4靈敏度試驗 用優化后的CPA反應體系進行擴增，檢測10倍梯度稀釋的陽性創傷弧菌菌液(原始濃度為1.28×108CFU/mL)。每個梯度重復3次，驗證方法重復性。同時利用創傷弧菌熒光PCR試劑盒(敏感性103copies/mL)進行平行測試。

1．3．5特異性試驗 用基因組DNA提取試劑盒提取作為陰性對照的銅綠假單胞菌、蠟樣芽胞桿菌、腸球菌、溶藻弧菌、河弧菌、霍亂弧菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、胎兒彎曲桿菌核酸和以及作為空白對照的腦心浸液培養基，在相同條件下用優化后的CPA反應體系對不同的基因組模板進行擴增，驗證方法的特異性。

2 結 果

2.1CPA最佳反應體系的確立 經過反復優化，確立了CPA的最佳反應體系，包含Buffer(1×)、dNTP(0.4 mmol/L)、Betaine(1 mol/L)、MgSO4(4 mmol/L)、VVF3(0.1 μmol/L)、VVB3(0.1 μmol/L)、VVDR1 (0.8 μmol/L)、VVCPF(0.8 μmol/L)、VVDR5F (0.4 μmol/L)、VVDF5B(0.5 μmol/L)、Bst DNA Polymerase(0.1 U/μL)、模板DNA 4 μL，補ddH2O至總體積20 μL。CPA反應條件：60 ℃恒溫擴增45 min。

2.2結果判定 CPA反應結束后，按照含核酸試紙條的全封閉式核酸檢驗裝置的操作說明書進行操作[8-9]。室溫靜置15～30 min，結果為陽性時，裝置中核酸免疫試紙條有兩條線(質控線和檢驗線)呈紅色；結果為陰性時只有質控線呈紅色。

2.3靈敏度試驗 對已定量的陽性創傷弧菌菌液(原始濃度為1.28×108CFU/mL)進行10倍梯度稀釋至1.28×101CFU/mL，平行做CPA與熒光PCR檢測靈敏度實驗。每個梯度重復3次，結果顯示CPA法對創傷弧菌菌液檢測靈敏度為1.28×103CFU /mL(見圖1)。創傷弧菌熒光PCR標準曲線圖如圖2，X軸是菌液濃度的對數值，Y軸是對應的Ct值，線性方程為Y=-3.571 X+42.173，相關系數為99.90%，擴增效率為90.57%。檢測靈敏度為1.28×102CFU /mL，平行檢測1.28×103CFU /mL對應的熒光信號曲線Ct值為30.5(見圖3)。CPA法與熒光定量PCR方法相比,靈敏度低一個數量級，但是結果判定直觀，操作簡便，成本低廉，可用于創傷弧菌的檢測。

注:1～8表示創傷弧菌菌液濃度為1.28×108 cfu/mL～1.28×101 cfu/mL;(+)：陽性對照；(-)：陰性對照；C為質控線；T為檢測線。圖1 CPA法檢測創傷弧菌菌液靈敏度試驗Fig.1 Sensitivity of the CPA assay

圖2 創傷弧菌菌液標準曲線Fig.2 Standard Curve of V. vulnificus by real-time PCR

注:1～8表示創傷弧菌菌液濃度為1.28×108 cfu/mL～1.28×101 cfu/mL圖3 熒光定量PCR檢測創傷弧菌菌液靈敏度結果Fig.3 Sensitivity of the assay was identified using 10-fold serial dilutions of V. vulnificus by real-time PCR

2.4特異性試驗 各取200 μL菌液進行DNA提取后，利用熒光PCR與CPA對51株創傷弧菌進行平行檢測，根據實驗室前期研究[10]的毒株分型創傷弧菌可分為有CB型、EA型、CAB型、CA型和EB型等亞型。針對以上亞型計算特異性和敏感性，5種亞型中除了CB亞型特異性和敏感性為95.65%和100%，其余亞型特異性和敏感性均為100%(P>0.05)，數據顯示兩種檢測方法無統計學差異，熒光PCR與CPA基本一致(見表2)。其余陰性對照銅綠假單胞菌、蠟樣芽胞桿菌、腸球菌、溶藻弧菌、河弧菌、霍亂弧菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、胎兒彎曲桿菌CPA檢測均為陰性(見圖4)。

注:1～9表示銅綠假單胞菌、蠟樣芽胞桿菌、腸球菌、溶藻弧菌、河弧菌、霍亂弧菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、胎兒彎曲桿菌；(+)：陽性對照；(-)：陰性對照； C為質控線；T為檢測線。圖4 CPA法特異性實驗結果Fig.4 Specificity of the CPA assay

表2 CPA與熒光定量PCR比較結果
Tab.2 Results for compare CPA with Real-time PCR(P>0.05)

MethodReal-time PCRPositiveNegativeTotalCBEACACABEBCPAPositive2224211050negative100002021Total5120 71

3 討 論

目前用于創傷弧菌檢驗的技術已由常規分離鑒定法[11]，發展到脂肪酸氣相色譜分析法[12]、膠體金免疫層析法[13]，分子生物學法如常規PCR[14]、多重PCR[15]、熒光定量PCR[16]等、變性高效液相色譜技術[17]等。這些技術可以在遺傳基因水平上檢測創傷弧菌，并鑒定毒力株和非毒力株，有助于快速準確地診斷創傷弧菌感染及預防和控制創傷弧菌的爆發。但是這幾種方法存在技術要求高、成本昂貴等缺點，很難在基層開展和實行。

本研究采用交叉引物恒溫擴增技術靶向創傷弧菌vvhA基因，針對靶序列特異性區域設計了1對外圍引物、1對交叉擴增引物、1對帶有生物素和熒光素標記的探針以及具有鏈置換功能的Bst DNA聚合酶，有機地將病原體DNA擴增、核酸雜交、核酸試紙條檢測和核酸檢測封閉裝置幾種技術融為一體，建立了創傷弧菌CPA快速檢測方法，40～60 min即可完成檢測，并且通過直接觀察核酸試紙條顯色判斷結果，簡單、便捷，對實驗人員和設備要求低，利于創傷弧菌的應急診斷、現場監測。同時由于全封閉式核酸檢驗裝置，可以避免靶核酸釋放到外界形成氣溶膠污染。

利用本研究中的創傷弧菌CPA-核酸試紙條快速檢測方法檢測實驗室留存的銅綠假單胞菌、蠟樣芽胞桿菌、腸球菌、溶藻弧菌、河弧菌、霍亂弧菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、胎兒彎曲桿菌核酸的結果與已知的菌株信息一致，僅創傷弧菌為陽性結果。針對本實驗室前期的研究，創傷弧菌毒株分型可分為CB型、EA型、CAB型、CA型和EB型等亞型。利用CPA法對以上亞型計算特異性和敏感性，5種亞型中除了CB亞型特異性和敏感性為95.65%和100%，其余亞型特異性和敏感性均為100%，說明建立的CPA方法具有良好的特異性。該CPA方法檢測靈敏度較高，檢測純培養的創傷弧菌靈敏度可達1.28×103cfu /ml。該CPA法檢測靈敏度與熒光定量PCR方法相比僅低一個數量級，但是成本低廉、操作簡便，有利于該技術的推廣，對創傷弧菌疫情的預防和控制，食品安全的加強具有重要意義。

利益沖突：無