胎兒彎曲菌PCR檢測方法的建立及其初步應用

唐 虹，徐仲蘭，孔 科，唐海燕，范正楊，焦新安，黃金林

胎兒彎曲菌(Campylobacterfetus，C.fetus) 屬于彎曲菌屬，包括胎兒彎曲菌胎兒亞種(C.fetussubsp.fetus)，胎兒彎曲菌性病亞種(C.fetussubsp.venerealis)和胎兒彎曲菌龜亞種(C.fetussubsp.testudinum) 3個亞種[1]。C.fetus呈弧形或S形，有鞭毛，革蘭染色陰性，是一種可導致人類腸外感染(如菌血癥、腦膜炎、關節炎、蜂窩組織炎等)，牛羊等牲畜流產、不育和生殖道炎癥等疾病的人獸共患病原菌，主要通過污染的水源、精液、流產的胎兒、糞便等進行傳播，給人的健康安全帶來巨大威脅，同時也對畜牧業造成嚴重的經濟損失[2]。

在人的腸道彎曲菌病中，90%是由空腸彎曲菌和結腸彎曲菌導致的，由C.fetus感染導致的案例較少[3]。但是Iraola G等人的最新研究表明人適應性C.fetus在人體內作為一種腸道致病菌能夠無癥狀攜帶，這大大增加了其在人與人之間傳播的可能性[4]。相反，在人彎曲菌菌血癥案例中，19%～53%是由C.fetus感染導致的，而且據報道其死亡率高達14%[5-7]。在國外C.fetus感染案例屢見不鮮，已然構成一個公共衛生問題，然而在國內有關C.fetus感染病例的報道極少，其流行傳播未能得到重視。C.fetus培養條件嚴苛，需要在微需氧環境(5% O2，10% CO2，85% N2)下才能生長，由于其培養和鑒定的特殊性導致日常工作中容易被忽視或錯誤鑒定。傳統的C.fetus鑒定方法是通過觀察形態、培養特性及生理生化特性等生物學特征，用以區分C.fetus與其他細菌。該方法耗時較長，難以適應現代診斷和研究需求，且傳統鑒定方法中能區分C.fetus與其他彎曲菌的特異性試驗較少，主要通過1%甘氨酸生長試驗、25 ℃和42 ℃溫度生長試驗、3.5% NaCl生長試驗、萘啶酮酸和頭孢霉素藥敏試驗、馬尿酸水解試驗以及氧化酶試驗等來區分C.fetus與其他彎曲菌，從分離培養到鑒定完成至少需要6～8 d，對于某些需要增菌處理的樣品，還需多耗費1～2 d[8]。由于彎曲菌種類繁多，生物學特性各異，難以將C.fetus與其他彎曲菌區分開，此外C.fetus生化變型中間種的存在，更是增加了其區分難度[9-10]。因此，本研究旨在建立一種特異性檢測C.fetus的PCR方法，為C.fetus感染的快速診斷、防控及深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1菌種 實驗菌株C.fetus標準株(NCTC10842)購自ATCC菌種庫，空腸彎曲菌(NCTC11168)由遵義醫學院孫萬邦教授惠贈，結腸彎曲菌、唾液彎曲菌、豚腸彎曲菌、鼠傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、惡臭假單孢桿菌、大腸桿菌、單核細胞增生李斯特菌、糞腸球菌、屎腸球菌、副干酪乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌、嗜低溫弓形菌、乳酸乳球菌、福氏志賀菌、副溶血弧菌、小腸腸球菌、格氏乳球菌、腸鏈球菌、金黃色葡萄球菌由本室保存。

1.2主要試劑 2 Taq Master mix(南京Vazyme公司)；DNA marker(大連TaKaRa公司)；厭氧罐、微需氧產氣袋(日本MGC公司)；Carry-Blair運送培養基(中國科學院上海昆蟲科技開發公司)；彎曲菌CCDA瓊脂和Bolton肉湯(英國OXOID公司)；無菌脫纖維綿羊血(北京Solarbio公司)；抗生素甲氧芐氨嘧啶、放線菌酮(日本Wako公司)；兩性霉素B(上海Uniche公司)；多粘菌素B(美國Amresco公司)；萘啶酮酸(青島海博公司)；525份臨床檢測樣品中，400份奶牛肛門擦拭樣品采自某奶牛養殖場，125份產婦陰道擦拭樣采自某婦幼保健院。

1.3 方 法

1.3.1引物設計 從GenBank中獲得C.fetus特異性基因sapB2序列(登錄號：AF048699)，應用軟件Primer Premier 5.0設計特異性引物(見表1)，經比對得知引物覆蓋區域與NCBI庫中已有的C.fetus菌株的同源性均為100%。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 PCR引物序列
Tab.1 Primers used for PCR

GenesPrimersPrimer sequences(5′-3′)Amplicon size/bpGene locationsapB2CFFACCGTCTTTGGCGTAT-TCGT7892509-2532CFRAACCCATCAACCTCAC-CCTT2943-2926

1.3.2細菌基因組DNA的提取C.fetus的DNA模板參照黃金林等方法制備[10]。將菌株接種于CCDA培養基上，37 ℃微需氧條件下培養36～48 h后挑取3～5個菌落，加到100 μL SW中用移液槍吹勻，沸水煮15 min，取出立即置于冰上，8 000 r/min離心5 min，吸取上清轉移至-20 ℃保存備用。同時提取菌株基因組DNA用于特異性及靈敏度試驗。

1.3.3PCR擴增條件優化 PCR擴增體系(25 μL)如下：DNA模板2 μL，2×Taq Master mix 12 μL，上下游引物(10 mmol/L)各1 μL，滅菌去離子三蒸水9 μL。配好體系瞬時離心10 s，使反應物集中于PCR管底部后再進行PCR擴增。PCR循環參數為：95 ℃ 7 min，95 ℃ 30 s，最佳退火溫度下45 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 7 min；4 ℃保存備用。取8 μL PCR擴增產物點樣，用1.0%的瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L溴化乙錠)，以PCR Marker DL2000作對照，100 V電泳45 min。凝膠在紫外燈下觀察，GelDoc 2000凝膠成像系統成像并保存圖片。利用建立的PCR方法，在53 ℃～60 ℃退火溫度范圍進行PCR反應，經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，確定最佳退火溫度。

1.3.4特異性試驗 用引物CFF/CFR對C.fetus、空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、唾液彎曲菌、豚腸彎曲菌以及鼠傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、惡臭假單孢桿菌等22種細菌進行PCR檢測，并通過電泳觀察PCR擴增結果。

1.3.5靈敏度試驗 用分光光度計測定C.fetusDNA模板的濃度后，分別作10倍梯度稀釋，每個梯度各取2 μL進行PCR擴增，并通過電泳觀察比較條帶亮度，直至不出現條帶。

1.3.6模擬污染試驗 收獲新鮮培養的C.fetus，用PBS作10倍梯度稀釋，同時每個梯度做菌落計數，然后將每個稀釋度各取10 μL菌液分別加入到10 mL污水、10 g奶牛糞便樣品中，向模擬污染樣品中加入90 mL增菌培養基，微氧條件下置于搖床上37 ℃ 120 r/min培養48 h。將菌液梯度稀釋后轉接至CCDA培養基上培養36～48 h后，挑取典型菌落3～5個，按上述煮沸法提取DNA模板，再用該PCR方法對可疑菌落進行鑒定，鑒定正確后對培養基上的陽性菌落進行計數。根據計數結果以及10 mL污水和10 g奶牛糞便樣品中C.fetus的污染量，計算該PCR檢測方法在兩類樣品中C.fetus檢測限。

1.3.7臨床樣品檢測 將本研究建立的PCR檢測方法應用于檢驗檢疫實際工作中。從某奶牛養殖場采集400份奶牛肛門擦拭樣品，同時連續10 d從某婦幼保健院共采集125份產婦陰道擦拭樣品，在兩類樣品采集過程中各隨機選取10個個體采集雙份樣品用于設置分離過程陽性對照組，樣品均用Carry-Blair運送培養基暫時保存，并于24 h內送至實驗室檢測。將棉拭子頭剪下置于無菌采樣袋中，實驗組直接加入10 mL增菌培養基進行增菌，對照組額外加入50 CFU的C.fetus，微氧條件下置于搖床上37 ℃ 120 r/min培養48 h。取菌液0.5 mL，8 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入100 μL滅菌去離子三蒸水，混勻后煮沸15 min，10 000 r/min離心5 min，吸出上清液作為DNA模板，用本研究建立的PCR方法進行C.fetus病原學檢測。同時對增菌產物以彎曲菌傳統的平板分離方法進行平行檢驗。

2 結果與分析

2.1PCR反應條件優化結果 在53 ℃～60 ℃退火溫度范圍對相同C.fetusDNA模板進行PCR擴增，擴增效果經瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖1所示，確定59 ℃時擴增效果最佳，即為最優退火溫度。PCR擴增的目的片段約789 bp，與預期結果(789 bp)相符。

M: DL2000 DNA Marker; 1-8: Annealing temperature of 53.0 ℃, 53.5 ℃, 54.3 ℃, 55.7 ℃, 57.3 ℃, 58.6 ℃, 59.5 ℃ and 60.0 ℃, respectively; 9: Negative control圖1 C.fetus溫度梯度PCR擴增結果Fig.1 Results of PCR amplification by temperature gradient of Campylobacter fetus

2.2特異性試驗 電泳結果顯示，僅C.fetus在789 bp處出現屬特異性條帶，而空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、唾液彎曲菌和豚腸彎曲菌均沒有條帶，其他17株參考菌株如沙門菌、大腸桿菌也均不能擴增出條帶(圖2)。

M: DL2000 DNA Marker; 1: C.fetus, 2: C.jejuni, 3: C.coli, 4: C.sputorrum, 5: C.hyointestinalis, 6: S.typhimurium, 7: S.pullorum, 8: P.putida, 9: E.coli, 10: L.monocytogenes, 11: E.faecalis, 12: E.faecium, 13: L.paracasei, 14: L.casei, 15: A.Cryaerophilus, 16: L.lactis, 17: S.flexneri, 18: V.parahaemolyticus, 19: E.hirae, 20: L.garvieae, 21: S.entericus, 22: S.aureus圖2 C.fetus PCR檢測方法的特異性Fig.2 Specificity test of PCR for the detection of C.fetus

2.3靈敏度試驗 用分光光度計測得C.fetus純培養物DNA模板濃度為227.23 ng/μL，對不同稀釋度的模板進行PCR擴增，最低在10-6稀釋度時能檢測到目的條帶。由此可知該PCR檢測方法最低可檢出0.23 pg/μL的C.fetusDNA(圖3)。

M: DL2000 DNA Marker; 1-7: 227.23×100 ng/μL-227.23×10-6 ng/μL圖3 C.fetus PCR檢測方法的敏感性Fig.3 Sensitivity test of PCR for the detection of C.fetus amplification

2.4模擬污染試驗 經人工模擬污染的污水、奶牛糞便樣品，通過增菌、平板選擇性培養以及PCR檢測，得知污水中C.fetus檢測限為0.9 CFU/mL，牛糞便樣品為20 CFU/g。

2.5臨床樣品檢測 用本研究建立的PCR方法對525份臨床樣品進行檢測，結果顯示525份臨床樣品均為C.fetus陰性，其中400份奶牛肛門擦拭樣品對應的10份對照組PCR檢測結果均為C.fetus陽性，125份產婦陰道擦拭樣品對應的10份對照組也均為C.fetus陽性。彎曲菌傳統平板分離方法同步檢測結果顯示，400份奶牛肛門擦拭樣品中檢出7份空腸彎曲菌陽性，2份唾液彎曲菌陽性，1份豚腸彎曲菌陽性，未檢測到C.fetus，10份對照組中，8份為C.fetus陽性，2份C.fetus陰性；125份產婦陰道擦拭樣品用傳統平板分離方法檢出1份空腸彎曲菌陽性，未檢出C.fetus，其10份對照組均為C.fetus陽性。實驗組中兩種檢測方法結果一致，均為C.fetus陰性；對照組中兩類樣品的PCR方法的回收率均為100%，奶牛肛門擦拭樣品平板分離法回收率為80%產婦陰道擦拭樣品平板分離法回收率為100%。PCR方法整個檢測過程僅需2 d，而傳統方法耗時7 d。

3 討 論

當今社會，隨著寵物家庭數量增加，人與動物親密接觸機會增多，此外人類食用多種生的或半熟肉制品，都大大增加了人感染人獸共患病的風險。C.fetus作為一種常見的人獸共患病原菌，其引起的感染常因其生長緩慢，培養條件特殊等特性以及傳統檢測技術耗時費力、診斷不準確而導致誤診或延誤治療。因此開發C.fetus快速檢測方法，以識別該病原菌的暴發流行，及時診斷和控制胎兒彎曲菌病顯得非常迫切和重要。

隨著核酸檢測技術的發展，越來越多的研究者將這項技術應用到診斷領域。本研究以C.fetus表面蛋白基因sapB2為靶基因，設計特異性引物，建立C.fetusPCR檢測方法。同源性比對結果顯示，sapB2基因在C.fetus不同亞種中的一致性均在82%以上，具有很高的保守性。試驗結果也證明，當以空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、唾液彎曲菌和豚腸彎曲菌這4個不同的彎曲菌種，以及17種其他細菌如大腸桿菌、屎腸球菌等作為參考菌株時，僅C.fetus能被擴增，說明該PCR方法具有較強的特異性。用本研究建立的PCR方法對C.fetus純培養物進行檢測，最低可檢出0.23 pg/μL的DNA，該結果與國內其他細菌PCR檢測方法結果相似[11-12]。對模擬污染樣品的檢測結果顯示，污水中C.fetus的最低檢測限為0.9 CFU/mL，奶牛糞便樣品中為20 CFU/g。該檢測結果與何蕊等人的結果基本一致，均具有較高的靈敏度[13]。

臨床樣品檢測過程中，400份奶牛肛門擦拭樣品PCR檢測結果均為C.fetus陰性，同樣傳統平板分離方法同步檢測結果也均為C.fetus陰性，兩者檢測結果相符，顯示該PCR方法具有良好的實用性。傳統平板分離方法同步檢測到空腸彎曲菌、唾液彎曲菌和豚腸彎曲菌的存在，但該PCR方法檢測結果中未產生非特異性條帶，再次表明其具有較好的特異性。400份樣品均未分離出C.fetus，這可能與該地區C.fetus的分布和流行情況有關。目前國內未有報道說該地區暴發過C.fetus感染[14]。10份對照組中，PCR檢測結果均為C.fetus陽性，平板分離法8份為C.fetus陽性，可能原因與樣品的增菌過程有關，肛門擦拭樣中含有多種腸道細菌如大腸桿菌、屎腸球菌等，這些細菌均為兼性厭氧菌，在營養豐富的彎曲菌增菌培養液中生長旺盛，增殖活躍，繁殖周期短，使得生長緩慢的彎曲菌失去生長優勢而被掩蓋，難以被傳統的平板分離法檢出，而靈敏度較高的PCR方法則只需微量的DNA就能將C.fetus檢出[15]。

綜上所述，本研究建立的C.fetusPCR檢測方法具有特異性強、敏感度高、簡便快速等特點，適用于食品和環境中彎曲菌的檢測，克服了傳統鑒定方法的不足，為C.fetus的快速檢測提供技術支持，對于識別該菌株的暴發流行，相關疾病的診斷、控制以及C.fetus分子流行病學研究具有重要意義。

利益沖突：無