杉木苗組織培養外植體的選擇及其消毒方法①

饒寶蓉

(福建省南平市農業科學研究所 福建建陽354200)

杉木［Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.］又名沙木、沙樹等，屬松柏目杉科喬木，高30 m，胸徑可達2.5～3 m，是我國特有的常綠針葉樹種之一。杉木栽培歷史悠久，地域分布十分廣闊，是我國南方山區重要的造林樹種之一［1］。杉木紋理順直、耐腐防蟲，廣泛用于建筑、橋梁、電線桿、造船、家具和工藝制品等方面。據統計，我國建材約有1/4是杉木。杉樹生長快，一般只要10 a就可成材，是我國南方最重要的特產用材樹種之一。

杉木種子育苗子代存在長勢參差不齊，出現變異株等不良性狀，而組織培養技術繁殖苗木的主要優點是能夠在短期內大量繁殖遺傳基因型比較一致的優良材料，充分利用繁殖材料的遺傳潛能，發揮最佳的效益［2-3］。從20世紀80年代就對杉木苗開展了無性系選育、扦插試驗，探索了杉木扦插生根的遺傳變異規律［4-6］。闕國寧［7-8］于1980年開始進行杉木組培技術試驗研究，探索了不同年齡母本上外植體的嫩梢增殖規律和成年母本外植體的組培復壯技術。但是，在杉木苗外植體選取，如何處理，以期更好地建立無菌體系研究方面較少。目前，木本科植物如紅豆杉、梧桐、紅楓等的組培快繁仍存在組培材料消毒困難、易褐化、增殖率低及生根困難等問題。無菌體系的建立是植物組培成功的關鍵。其中，外植體種類、取材部位和消毒方法是影響無菌體系建立的重要因素。自然條件下，植物外植體帶有較多的細菌和真菌，進行組培時需對其進行消毒滅菌，但要求不損傷其組織材料，保持生活力，使其在良好的培養條件下很快恢復生機，正常生長和繁殖［9-10］。較適的消毒方式能夠殺滅細菌，降低外植體的傷害，有助于其快速適應生長環境。通過調整消毒時間或消毒劑種類［11-13］，以及消毒后去除外層老化組織［14］等方法均能達到提高無菌率的效果。杉木苗與其他作物相比生長緩慢，新發嫩枝多發于春秋兩季、針葉多，莖表皮不光滑，感染率高且消毒后易褐化死亡，對其組培影響較大。為此，筆者于2015年以20 a苗齡杉木及種苗圃內1 a苗齡杉木的莖尖、莖段為外植體試材，對滅菌時間、外植體類型和取材時間等進行研究，以期篩選出杉木苗培養適宜的外植體類型，取材時間及其消毒方法，為杉木苗的無性繁殖提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以福建省建陽區國有林場杉木試驗林中選出20 a苗齡，樹干筆直，生長快、生物總量高、優質、耐瘠薄等優質的杉木的春秋新稍，和種苗圃內同棵數剪下枝條扦插成活的1 a苗齡的新稍作為組培試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體的預處理與接種后培養

將采回的外植體修剪成5 cm左右，剪去過長的針葉，除去表皮上的灰塵和雜物等，用洗潔精清洗并浸泡15 min，再用流水沖洗30 min，后用蒸餾水沖洗2次，轉入超凈工作臺，備用。處理好的外植體均接到MS+6-BA 0.8 mg/L+KT 0.5 mg/L的MS誘導培養基上培養。每瓶接一個外植體，外植體大小1 cm左右，轉接好后放入溫度（25±2）℃，光照強度1 500～2 000 lx，光照時間12 h/d條件下培養。

1.2.2 不同消毒時間對外植體消毒效果的影響

將外植體按1.2.1方法預處理后，先用75%酒精浸泡15～30 s，后將外植體用0.1%升汞消毒，分為4個處理，4處理的消毒時間分別為6、8、10和12 min，每處理均加入1～2滴吐溫80，振蕩后再用無菌水沖洗4～6次，每個處理接種90個，3次重復。20 d后觀察，統計。

1.2.3 不同外植體消毒效果比較

在春季將取回來的外植體按1.2.1方法進行預處理，后用1.2.2篩選出的方法進行消毒，將外植體分為3種類型，莖尖，莖段，去針葉莖段。每個處理接種90個，3次重復。20 d后觀察，統計。

1.2.4 不同取材時間對外植體消毒的影響

在春季4月和秋季9月連續取材，分別取苗齡1 a和20 a的植株嫩莖段。其中，外植體均去除莖尖后緊接的一段，接種時去除針葉。進行取材季節對外植體萌芽率的影響的比較。每個處理接種30個外植體，3次重復。

1.2.5 數據統計分析

各處理培養30 d后分別統計萌芽率、感染率、死亡率，采用Microsoft Excel整理數據，并采用JMP10.0軟件進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對莖段消毒效果的影響

莖段消毒后用無菌紙吸干水分，斜插于培養基上，暗培養2 d后進行光照，以減少其褐化。培養到第5天時，莖段開始出現感染，且感染主要發生在消毒時間為6、8 min的處理。在培養1～18 d時出現較多感染，18 d后感染減少；在培養第25天時沒有感染再發生，其中感染主要表現為霉菌感染。從表1可見，不同的升汞消毒時間，莖段的感染率、死亡率和萌芽率也隨之發生相應變化。消毒6～12 min，隨著消毒時間的延長，其感染率逐漸下降，死亡率則呈上升的趨勢。其中，消毒6 min莖段感染率最高，達83.33%，顯著高于8、10、12 min的，而萌芽率最低，只有6.66%；消毒10、12 min時的萌芽率分別為51.11%、43.33%，二者未達到顯著差異。綜合感染率、死亡率和萌芽率3個指標可見，莖段的最佳消毒時間為升汞消毒10 min。

表1 消毒劑處理時間的不同對莖段消毒效果的影響

2.2 不同外植體的消毒效果

表2可知：（1）從萌芽率上看，去針葉莖段的萌芽率最高，為40.00%，其次是莖段，萌芽率為28.33%，莖尖的萌芽率最低，為8.33%；去針葉莖段與莖段的萌芽率差異不顯著，但是兩者與莖尖的差異達顯著。（2）從感染率上發現莖尖的感染率最高，為80.83%。莖段感染率為50.00%，去針葉莖段感染率最低，僅為37.50%；莖尖的感染率顯著高于莖段和去針葉莖段，后二者差異未達到顯著。（3）死亡率方面，莖尖、莖段、去針葉莖段三者的死亡率分別為10.33%、21.66%、22.50%，三者均未達顯著差異。綜合3個指標可見，莖尖消毒困難，杉木的外植體以去針葉莖段為好。

表2 杉木不同類型外植體的消毒效果 單位：%

表3 不同取材時間杉木外植體的消毒效果 單位：%

2.3 不同采集時間對外植體消毒效果的影響

從表3可知，由于外植體采集時間，以及外植體的苗齡的不同，其體內貯藏的營養物質及其木質化程度也有差別，致使外植體的消毒難易程度不同。其中，苗齡小（1 a）的木質化程度比較低，春季、秋季采集萌芽率分別為73.33%、51.11%，均顯著高于苗齡大的（20 a），萌芽率為45.56%、12.78%。因此，相同季節采集的外植體，苗齡小的萌芽率優于苗齡大的。苗齡小的感染率顯著低于苗齡大的。這與苗齡小枝條木質化程度低，帶菌量少，較易消毒有關；同時，由于苗齡小處于生長期，其體內的酚類物質含量相對較高，使得外植體消毒后易出現褐化死亡，又因其較為幼嫩，消毒劑對其組織傷害也較大。因此，苗齡低感染率較低，但是褐化死亡率較高，分別為12.22%和14.44%。從表3還可以看出，在同苗齡的前提下，春季采集的莖段，其消毒效果優于秋季，如20 a苗齡的苗木，春季采集萌芽率45.56%，而秋季只有12.78%，達到顯著性差異。苗齡1 a的苗木，春季采集萌芽率為73.33%，與秋季的萌芽率53.11%達顯著性差異。綜合以上因素，在春季取材，選擇1 a苗齡的杉木有利于無菌體系建立。

3 討論與結論

研究結果表明，杉木的外植體選擇以莖段為好，且以消毒后去針葉的莖段進行組培效果最好，啟動率高，芽長勢好（圖1）；春稍比秋稍更有利于無菌體系建立，因此采集時間上比較，春季優于秋季。年限上，苗齡小比苗齡大的更有利于無菌系建立。苗齡小木質化低，更有利于細胞的增殖與分化，這與黃發新等［15］對不同生理老化程度的杉木組培效果中總結出杉木成年樹上部枝條組培時其芽分化數、嫩梢數和長度、生根率均極顯著地低于樹干根頸萌條，在機理上有一定的相似性。此外，杉木苗外植體在消毒過程中，消毒時間適當延長可以降低感染，但是會傷害到組織導致外植體死亡率升高，萌芽率下降。消毒時間與外植體木質化程度、暴露于空氣中的時間、雜菌等附作物有關，因此，外植體消毒時，要掌握好各個指標的平衡關系，盡量減少因消毒產生的對外植體的傷害，以免使外植體消毒后在培養過程中啟動慢，或者不啟動［16］。杉木苗組培過程中出現的褐化問題與唐軍榮等［17］在紅花山玉蘭組織培養外植體的選擇及其消毒方法一文中對紅花山玉蘭的研究有相似之處，都存在外植體極易產生褐化，在其切口處會分泌較多的酚類物質逐漸滲入到培養基，導致外植體死亡。該試驗通過添加活性炭和抗壞血酸及結合縮短轉接時間對降低外植體的褐化率起到了一定的效果。

圖1 杉木莖段外植體組培效果