深裂竹根七中酚類化合物種類與含量分析

李開金，馮婷婷，黃曄，林奇泗

（徐州醫學院藥學院，江蘇徐州221004）

深裂竹根七[Disporopsis pernyi（Hua）Diels]為百合科竹根七屬植物，它生長在海拔500 m～2 500 m 的南亞地區[1]。這種植物具有悠久的藥用歷史，用于治療慢性咳嗽、炎癥等病癥，但尚未被成功地進行人工栽培[2]。根據本課題組以往的研究表明，深裂竹根七乙酸乙酯提取物的抗氧化和抗菌作用強于氯仿、石油醚和正丁醇提取物，且其酚酸成分的活性較強[3]。因此，本研究選擇深裂竹根七的乙酸乙酯提取物為研究對象。曾有文獻報道，從深裂竹根七中分離出了蘆丁、木犀草素、槲皮素和樺木酸[4-5]。而液質聯用檢測是酚類化合物分析的重要分析技術之一。其中飛行時間質譜（time-offlight mass spectrometry，TOF-MS）可以在寬動態范圍內提供極好的質量準確度[6]。因此本研究采用液質聯用方法對這4 種酚酸成分進行檢測，驗證其是否存在于乙酸乙酯提取物中，并用超高效液相色譜進行含量測定。

1 儀器與材料

新鮮的深裂竹根七于2016年8 月從高山地區采集，地址位于貴州?。ń浂?106°56′～106°68′E；緯度26°42′～26°43′N；海拔 1 000 m～1 600 m）。將干燥的植物原料粉碎，過二號篩，風干備用。

沒食子酸（批號110831-201704）、蘆?。ㄅ?00080-201707）、木犀草素（批號 111520-201704）、槲皮素（批號100081-201703）、樺木酸（批號100135-201707）：中國藥品生物制品檢定所；福林酚試劑（色譜純）：上海阿拉丁化學試劑有限公司；乙腈（色譜級）：Caledon 實驗室（加拿大喬治敦）；超純水：杭州娃哈哈集團；乙醇、乙酸乙酯、甲醇等試劑均為分析純：山東禹王試劑公司。

Shimadazu Nexera X2 30A 超高效液相色譜：日本島津公司；BSA124S 型電子分析天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；TG332A 型微量分析天平：上海分析天平廠；Agilent UPLC/Q-Tof 液質聯用儀、Agilent1200系列高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司。

2 方法

2.1 乙酸乙酯提取物制備

深裂竹根七風干粉末（50 g）用500 mL 70%乙醇在90 ℃下提取1 h，重復3 次。合并濾液，將濾液于60 ℃下旋轉蒸發至無醇味。以乙酸乙酯為溶劑，采用液-液萃取法萃取乙醇提取物。用旋轉蒸發器減壓蒸發得到乙酸乙酯萃取物（ethyl acetate extraction，EAE）。EAE 的收率為1.9%，將其保存于4 ℃下備用。

2.2 總酚含量的測定

2.2.1 標準曲線的繪制

參考文獻方法[7-8]，以沒食子酸為對照品，用Folin-Ciocalteu 比色法測定EAE 中總酚含量。分別取100、200、300、400、500 mg/L 沒食子酸 80%甲醇溶液 50 μL，分別與 450 μL 的蒸餾水和 2.5 mL Folin-Ciocalteu 試劑混合。5 min 后，加入 2 mL 飽和碳酸鈉（75 g/L）在30 ℃間歇振蕩培養1.5 h 后，在765 nm 處測量所得藍色溶液的吸光度。以含量為橫坐標，吸光度為縱坐標建立標準曲線和回歸方程。

2.2.2 供試品含量的測定

取EAE 適量溶解在甲醇中定容，取50 μL 按2.2.1項下方法操作，測定吸光度，代入回歸方程計算?？偡雍恳詻]食子酸干燥物質量計，單位為mg/g。

2.3 液質聯用法鑒別EAE 中酚酸

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相A 和B 分別為水和乙腈，梯度程序為：95 %～90 % A 保留 10 min，90 %～60 % A 保留30 min，60 %～40 %A 保留 10 min，40 %～30 %A 保留5 min，30 %～20 %A 保留 10 min，20 %～10 %A 保留5 min，10%A 保留10 min。每次分析后再平衡時間為10 min。流速為 1.0 mL/min；進樣量 5 μL。

2.3.2 質譜條件

采用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），分析的參數設置在負離子模式下，在從M/Z 50～1 000的質量范圍內獲得的光譜。最佳ESI-MS 參數為：毛細管電壓3.5 kV，干燥氣體溫度180 ℃，干燥氣體流量8 L/min，霧化氣體壓力1.2 psi（1 psi=0.006 89 MPa）。

2.3.3 對照品溶液配制

精密稱取蘆丁、木犀草素、槲皮素和樺木酸對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成濃度約為1.0 mg/mL的對照品溶液，作為儲備液。

2.3.4 樣品檢測

取2.3.3 項下各對照品儲備液0.1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液在上述色譜和質譜條件下進樣分析。

供試品溶液的制備：精密稱取2.1 項下EAE 適量，加入色譜純甲醇溶解定容，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液在2.3.1 項下色譜和2.3.2 項下質譜條件進樣分析。

2.4 超高效液相色譜分析4 種酚酸含量

2.4.1 色譜條件

色譜柱為 Shim-pack XR-ODS column （1.6 μm，75 mm×2.0 mm）；柱溫：30 ℃；流速：0.2 mL/min；進樣量：5 μL；二極管陣列檢測器 Photodiode Array Detector；檢測波長：210、254 nm 和 280 nm。流動相 A 和 B 分別由0.1 % 甲酸溶液（pH 2.4）和乙腈組成。梯度順序為：95 %A 保留 2 min；95 %～90 %A 保留 2 min；90 %～60 %A 保存 6.5 min；60 %～40 %A 保存 2 min；40 %～30 %A 保存 1 min；30 %～20 %A 保存 2 min；20 %～10 %A 保存 1 min；10%A 保存 3 min。每次分析后再平衡時間為10 min。

2.4.2 標準曲線繪制

分別精密量取2.3.3 項下4 種酚酸對照品儲備液適量，加甲醇溶解并逐級稀釋至刻度，制成系列濃度的對照品溶液，按2.4.1 項下條件進樣，記錄色譜圖。以各色譜峰的峰面積A 為縱坐標，質量濃度C（μg/mL）為橫坐標，繪制標準工作曲線，計算回歸方程。

2.4.3 方法學考察

分別考察精密度、重現性、24 h 內的穩定性及回收率。

2.4.4 樣品含量測定

分別精密稱定3 批2.1 項下EAE 適量，加甲醇配制成溶液，按2.4.1 項下條件進樣，將峰面積代入回歸方程，計算含量。

3 結果與討論

3.1 總酚含量

提取物中的總酚含量由校準曲線導出的回歸方程（y=24.02x-0.053，R＝0.999 3）。將樣品吸光度代入回歸方程計算，EAE 含量為（35.3±1.03）mg/g。結果表明，深裂竹根七乙酸乙提取物中含有大量的酚類化合物。

3.2 液質聯用法分析酚酸成分

用反相高效液相色譜與電噴霧電離串聯質譜分析法從EAE 檢測出了4 種酚類化合物，因為使用的是負離子模式，故所得的離子為[M-H]-。所獲得的離子流圖如圖1 所示，數據見表1。

圖1 基峰離子流圖Fig.1 The base peak chromatogram

表1 EAE 中4 種成分峰的HPLC-ESI Q-TF-MS 數據Table 1 HPLC-ESI-Q-TOF-MS data for EAE

3.3 超高效液相色譜法測定4種酚酸含量

測定將供試品峰面積代入回歸方程，方法學考察和回歸方程見表2，色譜圖見圖2。

深裂竹根七乙酸乙酯提取物中蘆丁、木犀草素、槲皮素和樺木酸的含量分別為 （5.63±0.15）、（2.51±0.10）、（3.87±0.12）、（2.41±0.09）μg/g，結果以干重計。

本研究采用反相高效液相色譜與電噴霧電離串聯質譜分析聯用技術對深裂竹根七EAE 中4 種酚類化合物進行了分離和鑒定。質譜法檢測的優點包括確定分子量和獲得結構信息的能力。酚類化合物的響應靈敏度對負離子極性較好，因為酚類化合物的酚羥基或羧基容易與溶液中的陰離子解離。因此，采用了負離子模式進行分析。

表2 4 種化合物的方法學考察Table 2 Methodology of the four analytes

圖2 乙酸乙酯提取物超高液相色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of EAE

本研究采用UPLC 法測定了深裂竹根七中的蘆丁、木犀草素、槲皮素和樺木酸4 種成分含量。這4 種組分曾被文獻報道用系統分離法分離得到。故而本研究針對這4 種成分建立含量測定方法。曾使用高效液相法測定這4 種成分，需要費時90 min，而改用UPLC法只需20 min，大大節省了檢測時間。