牦牛乳及其制品中苯甲酸來源分析及影響因素研究

余曉琴，李道霞，黃麗娟，唐昌云

（四川省食品藥品檢驗檢測院，四川成都610097）

苯甲酸（benzoic acid，BA）又稱安息香酸[1]，在很多食品中天然存在，包括乳及乳制品[2-3]，研究表明原料乳中馬尿酸在乳酸菌等微生物作用下轉化為苯甲酸[4]。食品添加劑安全性評價的權威機構-聯合國糧農組織和世界衛生組織下的食品添加劑聯合專家委員會認為苯甲酸的每日允許攝入量為0～5.0 mg/kg 體重。安全劑量的苯甲酸不會對人體產生不利影響，但肝功能缺陷或衰弱者不宜多食用含苯甲酸的食品。不少文獻曾報道普通奶牛牛乳及乳制品中苯甲酸與馬尿酸的含量變化趨勢[5-9]，但大部分研究缺少系統性的影響因素的驗證。馬尿酸（hippuric Acid，HA）又稱苯甲酰甘氨酸、苯甲酰氨基乙酸，是食植動物代謝的副產物[7]，為牛乳中的天然成分，其濃度為30 mg/L～60 mg/L[8-10]。初步研究發現牦牛全脂乳粉中檢出一定量的苯甲酸，而大部分樣品高于文獻報道[11]的普通奶牛全脂乳粉中苯甲酸的含量。牦牛乳及其制品作為高原地區牧民主要經濟來源之一，具有極高的營養價值[12-13]。與規模化養殖相比，牦牛養殖以家庭分散經營、傳統放牧模式為主，現代化程度低，奶牛食草為主，人工擠奶，無固定擠奶場地，擠奶場地缺少衛生保障措施等[14-15]，這些因素可能都會帶來一定的影響。因此，為研究牦牛乳全脂乳粉中苯甲酸偏高這一關鍵問題，充分結合牦牛的生長環境、擠奶方式等特殊狀態，建立牦牛乳及乳制品中馬尿酸、苯甲酸測定方法，以該方法為基礎檢測牦牛乳及其制品中馬尿酸、苯甲酸含量，分析馬尿酸、苯甲酸含量轉化關系，并研究二者轉化的影響因素，為牦牛乳安全控制奠定研究基礎，促進高原牦牛乳產業發展。

1 材料與方法

1.1 馬尿酸、苯甲酸檢測

1.1.1 主要儀器與試劑

1.1.1.1 儀器與試劑

UltiMate 3000 高效液相色譜儀：美國ThermoFisher Scientific 公司；Milli-Q 超純水純化系統：美國Millipore 公司）；Neofuge 23R 臺式高速離心機：美國ThermoFisher Scientific 公司；渦旋混合器：德國IKA 公司；賽多利斯 TP-114 電子天平：美國 Sartorious 公司；0.45 μm PTFE 膜針頭過濾器：美國 PALL 公司；0.45 μm PTFE濾膜：上海安普科學儀器有限公司；甲醇：色譜純，德國Merck 公司；亞鐵氰化鉀（K4[Fe（CN）6]·3H2O）、乙酸鋅（C4H6O4Zn·2H2O）、氫氧化鈉（NaOH）、硫酸（H2SO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO·43H2O）、磷酸（H3PO）4（以上均為分析純）：天津科密歐公司；實驗用水為二次蒸餾水；pH 試紙：上海馨晟試化工科技有限公司。

1.1.1.2 標準品

苯甲酸（純度 99.5%）：Dr.Ehrenstorfer；馬尿酸（純度98%）：中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 標準溶液的配制

標準儲備液：稱取馬尿酸、苯甲酸標準品50.0 mg、25.0 mg，分別置50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻，4 ℃冷藏，有效期 3 個月。

混合標準溶液：使用甲醇水溶液（50/50，體積比）對標準儲備液進行梯度稀釋，得到系列混合標準溶液。

1.1.3 樣品預處理

樣品預處理參照國家食品安全標準乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的測定[16]，稱取混勻液體樣品10 g或固體樣品1.0 g，精密稱定，于100 mL 比色管中，加入25 mL 氫氧化鈉溶液（0.1 mol/L），劇烈震搖5 min（或者超聲處理5 min）。用硫酸溶液（0.5 mol/L）調節pH值至8 左右，依次加入2 mL 亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）和 2 mL 乙酸鋅溶液（183 g/L），劇烈震搖 5 min（或者超聲5 min），靜置15 min，冷卻至室溫后，全部轉移至100 mL 容量瓶中用甲醇溶液（50/50，體積比）定容至刻度，8 000 r/min 離心 10 min，上清液過 0.45 μm 濾膜。續濾液作為試樣溶液，待高效液相色譜儀測定。

1.1.4 參考色譜條件

色譜柱：Agilent XDB C18（150 mm×4.6mm，5 μm）；流動相：甲醇：磷酸鹽緩沖溶液（分別稱取2.5 g 磷酸二氫鉀和2.5 g 磷酸氫二鉀于1 000 mL 容量瓶中，加900 mL 水溶解，磷酸調節pH 質至6.7，用水定容到刻度后混勻，用濾膜過濾后備用）=8∶92（體積比）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：227 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；分析時間：11 min。

1.2 試驗用樣品種類

牦牛乳（奶）（Yak milk）包括：乳頭奶A（Nipple milk A）、乳頭奶 B（Nipple milk B）、混合牦牛奶（Mixed yak milk）。牦牛乳制品包括：牦牛全脂乳粉（Yak whole milk powder）。

乳頭奶A：直接從牦牛乳頭采集的牛奶，一頭奶牛為一個樣本。采集方式：牧民佩戴無菌手套，擠奶前用75%消毒酒精分別對牦牛乳頭及手套消毒三次，棄去前20 mL～30 mL 奶后，將后續牛奶接至經高壓滅菌處理的玻璃容器中，加蓋并封口。

乳頭奶B：直接從牦牛乳頭采集的牛奶，一頭奶牛為一個樣本。采集方式：根據牧民日常擠奶方式（未佩戴手套、未對乳頭進行消毒、未去前20 mL～30 mL奶），將牛奶自乳頭接至經高壓滅菌處理的玻璃容器中，加蓋并封口。

混合牦牛奶：牧民家存儲桶或奶站存儲桶里儲存的混合奶，一個桶為一個樣本。采集方式：從儲奶桶直接轉移至經高壓滅菌的玻璃容器中，加蓋并封口。

1.3 乳頭奶A中馬尿酸、苯甲酸檢測

采用隨機抽樣的方法，共采集175 個乳頭奶A 樣品，測定牦牛乳中馬尿酸和苯甲酸含量。

1.4 混合牦牛奶中馬尿酸、苯甲酸檢測

采用隨機抽樣的方法，采集10 個混合牦牛奶，測定牦牛乳中馬尿酸和苯甲酸含量。

1.5 牦牛乳制品中馬尿酸、苯甲酸檢測

隨機從超市購買19 批牦牛全脂乳粉進行檢測。

1.6 牦牛乳中微生物檢測（菌落總數）

參考GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》，檢測乳頭奶A（10 個）、乳頭奶 B（10 個）、混合牦牛奶（10 個）中微生物情況。

1.7 乳頭奶B中馬尿酸、苯甲酸含量變化

根據牧民擠奶及儲存牦牛乳的溫度、時間等因素，將乳頭奶 B（1 個）分為若干份，分別置 4、18、30 ℃保存，于 0、1、2、4、6、8、12、24、48、96 h 時檢測其馬尿酸、苯甲酸含量及其變化，考察溫度、時間的影響。

1.8 滅菌與未滅菌乳頭奶B中馬尿酸、苯甲酸含量變化

乳頭奶B（1 個）分為若干份，對部分進行滅菌處理，然后將滅菌、未滅菌樣品置18 ℃保存，于不同時間點檢測馬尿酸、苯甲酸含量，考察微生物的影響。

2 結果與分析

2.1 馬尿酸、苯甲酸檢測

2.1.1 樣品前處理的選擇

參考食品安全國家標準食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定[16]，加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白后，將超聲處理改為劇烈振搖，使該方法可用于牧場現場快速制樣。

2.1.2 分析條件的選擇

參考郭文麗等[17]研究，調整流動相中磷酸緩沖液比例及篩選磷酸鹽緩沖液pH 值，最終確定以甲醇∶磷酸鹽緩沖液=8∶92（體積比）（pH=6.7）作為流動相，馬尿酸與苯甲酸能夠得到有效分離，且不受其他物質干擾，如圖 1～圖3 所示。

2.1.3 線性方程與檢測靈敏度

圖1 試劑空白圖譜Fig.1 Chromatogram of reagent blank

圖2 馬尿酸（0.844 μg/mL）、苯甲酸（1.979 3 μg/mL）標準品圖譜Fig.2 Standard chromatograms of hippuric acid（0.844 μg/mL）and benzoic acid（1.979 3 μg/mL）

圖3 牦牛全脂乳粉圖譜Fig.3 Chromatogram of yak whole milk powder

以甲醇水溶液（50/50，體積比）稀釋標準儲備液得到馬尿酸濃度為 0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L，苯甲酸濃度為 0、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5 mg/L 的標準系列溶液，采用本方法進行測定。標準溶液的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸。采用標準溶液色譜峰的信噪比（S/N）≥3 作為檢出限（limit of detection，LOD），結果見表 1。

表1 馬尿酸、苯甲酸的線性范圍、線性方程、相關系數（r）、檢出限Table 1 Linear range，regression equations，correlation coefficients（r），LODs of HA and BA

結果表明，2 種化合物在設定的濃度范圍內線性關系良好，相關系數（r）大于0.999（見表1）。

2.1.4 準確度（添加回收率）與精密度

取已知含量的牦牛乳及牦牛全脂乳粉樣品，分別做 0.5、1.0、20.0 mg/kg 濃度水平、6 平行的加標回收率實驗，按照本方法進行前處理和進樣分析，結果見表2。

表2 馬尿酸、苯甲酸的平均回收率及相對標準偏差（n=6）Table 2 Average recoveries and relative standard deviations of HA and BA（n=6）

由表2 可知，兩種化合物的回收率為93.0 %～106.1%，RSD 不大于5.7%，說明該方法的精密度和準確度均較高。

2.2 牦牛乳及其制品中馬尿酸、苯甲酸含量測定

2.2.1 乳頭奶A 中馬尿酸、苯甲酸含量測定

對175 個乳頭奶A 檢測結果如圖4 所示。

圖4 牦牛乳頭奶中馬尿酸含量Fig.4 Content of hippuric acid in yak nipple milk

結果表明，乳頭奶中均未檢出（測得含量低于方法檢出限，not detected，ND）苯甲酸，馬尿酸檢出的含量范圍為 22.71 mg/kg～79.73 mg/kg。

2.2.2 混合牦牛奶中馬尿酸、苯甲酸含量測定

對10 個混合牦牛奶的檢測結果表明，混合奶中苯甲酸含量在未檢出至2.2 mg/kg 之間，馬尿酸含量范圍為 26.8 mg/kg～74.9 mg/kg，檢測結果如表3 所示。

表3 混合牦牛乳中馬尿酸、苯甲酸含量Table 3 Content of hippuric acid and benzoic acid in mixed yak milk

2.2.3 牦牛全脂乳粉中馬尿酸、苯甲酸含量測定

對19 批市售牦牛全脂乳粉檢測，結果見表4。

表4 牦牛全脂乳粉中馬尿酸、苯甲酸含量Table 4 Content of hippuric acid and benzoic acid in yak whole milk powder

如表4 所示，在購買的19 批牦牛全脂奶粉中馬尿酸含量范圍為48.8 mg/kg～279.7 mg/kg，苯甲酸含量范圍為 53.0 mg/kg～213.5 mg/kg。

2.3 乳頭奶A、乳頭奶B及混合牦牛奶中微生物檢測

本研究中以菌落總數為代表反應牦牛乳中微生物污染情況，參考GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物檢驗菌落總數測定》分別檢測乳頭奶A、乳頭奶B 及混合牦牛奶中微生物數量，結果如表5 所示。

表5 牦牛奶中菌落總數Table 5 Total number of colonies in yak milk

大部分樣品中均含有一定量的微生物，其中乳頭奶B 中微生物數量均顯著高于乳頭奶A，混合牦牛奶中微生物最多。

2.4 乳頭奶B中馬尿酸、苯甲酸含量變化及影響因素

在本研究中，將乳頭奶B（NO.10，馬尿酸含量為35.20 mg/kg，未檢出苯甲酸，菌落總數為 1.3×105CFU/g）分為若干份，于不同條件下放置一定時間后分別檢測其中馬尿酸、苯甲酸含量，以研究牦牛乳中馬尿酸、苯甲酸含量變化與時間、溫度、微生物的關系。

2.4.1 溫度、時間對乳頭奶B 中馬尿酸、苯甲酸含量變化的影響

取3 份樣品，分別置不同溫度條件下保存，于不同時間進行檢測。溫度、時間對牦牛乳中馬尿酸、苯甲酸含量的影響如圖5 所示。

圖5 溫度、時間影響牦牛乳中馬尿酸、苯甲酸含量變化Fig.5 Effects of temperature and time on HA and BA in yak milk

在0～12 h 內，30 ℃條件下苯甲酸增加的趨勢顯著大于 4、18 ℃條件下，放置 12 h 后，30 ℃條件下的牦牛乳樣品中未檢出馬尿酸，苯甲酸含量為20.85 mg/kg，之后苯甲酸含量趨于穩定。放置48 h 后，18 ℃條件下的牦牛乳樣品中未檢出馬尿酸，苯甲酸含量為19.20 mg/kg。放置96 h 后，4 ℃條件下的牦牛乳樣品中馬尿酸含量為6.52 mg/kg，苯甲酸含量為16.94 mg/kg。結果顯示，隨著存放時間的延長，牦牛乳馬尿酸含量逐漸降低，苯甲酸含量逐漸增加，且溫度越高變化越快。

2.4.2 微生物對乳頭奶B 中馬尿酸、苯甲酸含量變化的影響

取4 份樣品，對其中3 份進行滅菌處理（滅菌條件：95 ℃，30 min[18]），得滅菌（S）、未滅菌（N-S）兩種樣品，然后將4 份樣品置18 ℃條件下保存。兩種樣品各取一份于不同時間進行檢測，另外兩份滅菌樣品分別于24、96 h 時檢測。結果見表6。

表6 微生物影響牦牛乳中馬尿酸、苯甲酸含量變化（18 ℃）Table 6 Effects of microorganism on HA and BA in yak milk（18 ℃）

在0 h 時，滅菌、未滅菌牦牛乳樣品菌落總數分別為＜10 CFU/g、1.3×105CFU/g。微生物對牦牛乳中馬尿酸、苯甲酸含量的影響如表6 所示。與未滅菌樣品相比，滅菌樣品開封后96 h 內，馬尿酸含量緩慢降低。而未開封的滅菌樣品放置96 h 后馬尿酸含量變化不顯著，且未檢出苯甲酸。結果顯示，微生物含量較低時，即使延長放置時間，其馬尿酸、苯甲酸含量變化不大，且滅菌后密封保存96 h，其馬尿酸、苯甲酸含量幾乎無變化。結合2.4.1 研究結果，說明與溫度、放置時間相比，牦牛乳中微生物數量對放置過程中馬尿酸、苯甲酸含量變化影響更大。

3 結論與討論

1）本研究證實牦牛乳及其制品中苯甲酸主要是由天然馬尿酸轉化產生，微生物、溫度及儲存時間均是影響牦牛乳中馬尿酸、苯甲酸含量變化的關鍵因素，其中微生物的影響更為主要。

2）牦牛的養殖主要為散養、奶牛以食草為主，人工擠奶、擠奶場所不固定、擠奶環境衛生控制的可能不理想，牧場和奶站等若缺乏有效的除菌設施，這些情況均易導致牦牛乳中微生物數量增加；另外，高原幅員遼闊，牦牛乳儲存及運輸過程中溫度控制措施簡單，易導致在該過程中微生物大量繁殖，進而引起牦牛乳中的馬尿酸轉化為苯甲酸，可能進一步導致牦牛乳制品中苯甲酸含量偏高。

3）本研究表明不同擠奶方式會導致牦牛奶中微生物數量差異，在擠奶前對牦牛乳頭進行消毒，可有效降低牦牛乳頭奶中微生物數量。儲奶容器及儲奶環境均會影響牦牛乳中微生物數量。