食品中磺酰脲類除草劑的高效液相色譜分析

趙國棟，何豐瑞，秦國富

（西安市疾病預(yù)防控制中心，陜西西安710054）

磺酰脲類除草劑已廣泛用于防除稻田、大豆、玉米田中的雜草，隨著人們對環(huán)境污染物健康危害認(rèn)識的增加，農(nóng)藥殘留對人類健康和環(huán)境的影響受到公眾廣泛關(guān)注。各種磺酰脲類除草劑選擇性較強(qiáng)，對不同作物的敏感性差異較大，因而磺酰脲類除草劑的殘留會對特定的農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)生次生藥害。其次，由于磺酰脲類除草劑抗藥性的作用位點單一，雜草對它們很快可產(chǎn)生抗藥性。據(jù)國外報道，此類除草劑連續(xù)施用3年～5年后，雜草就可能產(chǎn)生一定的抗藥性[1]。國內(nèi)外對該類除草劑的多個品種規(guī)定了最大殘留限量。因此，為了保護(hù)我國農(nóng)民的收入和增加糧食產(chǎn)量，建立快速、可靠的同時檢測食品中磺酰脲類除草劑多殘留的方法具有一定的實際意義。

食品樣品的基質(zhì)通常較為復(fù)雜，磺酰脲類除草劑在其中的含量亦較低，因此，測定磺酰脲類除草劑時，通常需要進(jìn)行一定的濃縮和凈化處理。目前，文獻(xiàn)報道的前處理方法主要以固相萃取（solid phase extraction，SPE）[2-5]和液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）[6]為主，其他的輔助方法有薄層析（thin-layer chromatography，TLC）和超臨界萃取（supercritical fluid extraction，SFE）等[7]。測定方法主要以高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）-紫外檢測和液質(zhì)聯(lián)用（liquid chromatography - mass spectrometry，LCMS）為主[8-11]，其主要是檢測單一農(nóng)藥，混合農(nóng)藥的檢測鮮有報道[2，8]。本試驗選擇7 種磺酰脲類除草劑作為檢測對象，建立其HPLC-紫外檢測分析法，并對測試條件進(jìn)行詳細(xì)的考察。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AKTApurifier 液相色譜儀：通用電氣（中國）醫(yī)療集團(tuán)；SL252 型電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；TGL-16B 型高速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀：北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；CXW-170 吸油煙機(jī)：中山市黃圃鎮(zhèn)澳洲廚具電器廠；眾愛多功能食品料理機(jī)：上海眾愛電器有限公司；KQ-250 型超聲波清洗器：昆明市淀山湖檢測儀器廠；ASH-1200-C 型艾科浦超純水機(jī)：重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司；Supelco 固相萃取裝置：北京康林科技有限責(zé)任公司。

除草劑標(biāo)準(zhǔn)：甲磺隆、苯磺隆、吡嘧磺隆，丙苯磺隆、甲磺胺磺隆（純度均高于97.5%）：德國DR 公司；氯磺隆、芐嘧磺隆（純度均高于97.5%）：Sigma 公司。

除草劑標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取上述7 種除草劑標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配成濃度為1.00 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于-20 ℃冰箱中保存。

乙腈（色譜純）：德國Merk 公司；甲醇（色譜純）、鹽酸（優(yōu)級純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

樣品：大豆、玉米、大米，均購于農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil MPC18柱（100A0，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A 相為甲醇-乙腈（體積比 1∶1），B 相為 0.001 mol/L 鹽酸，梯度洗脫程序：0～2CV，B 相為33%→2CV～3CV，B 相為 0%→3CV～4CV，B 相為 33%（CV 表示柱體積；1CV=4.155mL）；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：220、230、240 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取一定量各除草劑的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇逐級稀釋，配制成濃度為 0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、25.00、100.00 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。進(jìn)樣 10 μL，以待測除草劑的濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線或求出線性回歸方程。

1.2.3 樣品采集與處理

大米和玉米樣品：將樣品用勻漿機(jī)打碎后，稱取5.0 g 左右，加入20 mL 甲醇，放入超聲波清洗器超聲20 min，取上清液10 mL 氮氣吹干，用1 mL 甲醇溶解殘渣，15 000 r/min 離心5 min 后接進(jìn)樣測定。

大豆樣品：稱取適量勻漿樣品，加入20 mL 甲醇放入超聲波清洗器超聲20 min，取上清液10 mL 加入已活化好的C18小柱，用5 mL 甲醇分5 次洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干，用1 mL 甲醇溶解殘渣，150 000 r/min離心5 min 后接進(jìn)樣測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 測定波長的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報道，磺酰脲類除草劑通常在210 nm～260 nm 處有吸收峰[12]，考慮到在較低波長下檢測干擾較為嚴(yán)重，試驗在220 nm～240 nm 波長進(jìn)行比較。試驗結(jié)果表明，在220 nm 波長處甲磺隆和氯磺隆的靈敏度最高，在230 nm 處甲磺胺磺隆、丙苯磺隆和苯磺隆的靈敏度最高，而在240 nm 處芐嘧磺隆和吡嘧磺隆的靈敏度最高。

2.1.2 流動相的優(yōu)化

由于磺酰脲類除草劑呈弱酸性，為了能使其能得到較好的峰形，通常在酸性流動相中進(jìn)行色譜分離[12]。分別用一定比例甲醇-鹽酸水作為流動相進(jìn)行試驗，氯磺隆與丙苯磺隆不能完全分離。改用一定比例的乙腈-鹽酸水進(jìn)行色譜分離，苯磺隆與丙苯磺隆不能完全分離。因此，試驗選擇流動相中有機(jī)相為乙腈和甲醇混合溶液（體積比1∶1），并在此基礎(chǔ)上考察了有機(jī)相和鹽酸水的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有機(jī)相-鹽酸水體積比為67∶33 時，所有待測除草劑能達(dá)到基線分離，但吡嘧磺隆出峰時間太長，超過30 min，因此在其他除草劑出峰完全后，將有機(jī)相比例提高至100%進(jìn)行沖洗，以縮短吡嘧磺隆的保留時間，在此梯度程序下混合標(biāo)準(zhǔn)分離，一次分析在20 min 內(nèi)可完成。

2.1.3 流速的選擇

高效液相色譜的流速與出峰時間成反比。流速越大，出峰越快，分析周期越短。試驗在0.8 mL/min～1.2 mL/min范圍內(nèi)考察了流速磺酰脲類除草劑的影響，試驗結(jié)果表明：流速在上述范圍內(nèi)各待測物的分離度均滿足色譜分離的要求，考慮到分析時間和柱壓，試驗選擇1 mL/min流速進(jìn)行試驗。在上述選擇的最適色譜條件下進(jìn)行分析，得到混合標(biāo)準(zhǔn)和樣品色譜圖，詳見圖1～圖4。

2.2 樣品處理

由于樣品是顆粒性物質(zhì)，直接用甲醇或乙腈提取效果較差，所以用勻漿機(jī)打碎后再提取，稱取勻漿后的樣品5 g 左右，分別加入20 mL 甲醇和乙腈后用超聲波清洗器超聲萃取20 min，考察了甲醇和乙腈的提取效率，以回收率作為考察指標(biāo)，結(jié)果表明，兩者提取效果相差不大，考慮到甲醇毒性較小且經(jīng)濟(jì)適用，故本次試驗采用甲醇作為提取液。

因樣品中的磺酰脲類除草劑濃度可能較低，因此進(jìn)行了樣品的濃縮，取甲醇提取液10 mL，氮吹儀吹干后，1 mL 甲醇溶解殘渣，上清液進(jìn)樣分析。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 Mixed standard chromatogram

圖2 玉米樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of corn sample

圖3 大豆樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of soybean sample

圖4 大米樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of rice sample

按上述提取和濃縮的程序進(jìn)行樣品處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大米和玉米樣品干擾較少，不影響待測物的分析，而大豆樣品干擾較多，部分干擾物對待測物出峰有影響。因此，用分別用液液萃取和固相萃取小柱對大豆樣品進(jìn)行了凈化。液液萃取采取在提取液中加入一定量的正己烷進(jìn)行，固相萃取采取C18小柱進(jìn)行凈化，比較兩者的凈化效果，結(jié)果表明，液液萃取效果遠(yuǎn)比C18小柱凈化效果差；在此基礎(chǔ)上，考察了C18小柱的洗脫條件，結(jié)果表明，上樣后，直接用甲醇洗脫就能取到明顯的凈化效果。試驗用1 mL～5 mL 甲醇分別進(jìn)行洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用5 mL 甲醇分5 次洗脫后，樣品中的待測物洗脫完全（C18小柱活化：乙腈、甲醇和水各5 mL洗脫）。

2.3 方法指標(biāo)的考察

2.3.1 線性范圍和檢出限

在優(yōu)化的分離條件下，配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所測定的磺酰脲類除草劑在濃度 0.5 μg/mL～100.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好（r=0.995 5～0.999 2）；以基線3 倍噪聲對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作為方法的檢出限，結(jié)果見表1。

2.3.2 精密度試驗

對同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，連續(xù)8 次進(jìn)樣測定，根據(jù)保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差考察精密度。試驗結(jié)果如表2。

表1 磺酰脲類除草劑的線性方程和檢出限Table 1 Linear equation and detection limit of sulfonylurea herbicides

2.3.3 加標(biāo)回收試驗

分別將玉米與大豆樣品平均分成12 份，其中各3份用于本底值測定，另外每3 份各加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品測定步驟進(jìn)行測定，并計算加標(biāo)回收率，得到的加標(biāo)回收率在81.0 %～116.1 %，結(jié)果見表3。

表2 標(biāo)準(zhǔn)測定的精密度試驗結(jié)果Table 2 Precision test results of standard measurement

表3 加標(biāo)回收試驗結(jié)果Table 3 Spiked recovery experiment results

2.4 樣品的測定

用本文所建立的方法測定了大米、玉米與大豆。大米均未檢出上述7 種除草劑；而玉米檢出了甲磺隆，含量為 7.78 μg/g；大豆檢出了芐嘧磺隆，含量為 10.94 μg/g。

3 結(jié)論

綜上所述，本法采用C18小柱固相萃取，高效液相色譜分析了樣品中7 種磺酰脲類除草劑的殘留量，并成功用于實際樣品的檢測。本方法的操作簡便、檢測周期短，20 min 即可完成檢測，適合食品樣品中磺酰脲類除草劑的快速分析。