食品中磺酰脲類除草劑的高效液相色譜分析

趙國棟，何豐瑞，秦國富

（西安市疾病預防控制中心，陜西西安710054）

磺酰脲類除草劑已廣泛用于防除稻田、大豆、玉米田中的雜草，隨著人們對環境污染物健康危害認識的增加，農藥殘留對人類健康和環境的影響受到公眾廣泛關注。各種磺酰脲類除草劑選擇性較強，對不同作物的敏感性差異較大，因而磺酰脲類除草劑的殘留會對特定的農產品產生次生藥害。其次，由于磺酰脲類除草劑抗藥性的作用位點單一，雜草對它們很快可產生抗藥性。據國外報道，此類除草劑連續施用3年～5年后，雜草就可能產生一定的抗藥性[1]。國內外對該類除草劑的多個品種規定了最大殘留限量。因此，為了保護我國農民的收入和增加糧食產量，建立快速、可靠的同時檢測食品中磺酰脲類除草劑多殘留的方法具有一定的實際意義。

食品樣品的基質通常較為復雜，磺酰脲類除草劑在其中的含量亦較低，因此，測定磺酰脲類除草劑時，通常需要進行一定的濃縮和凈化處理。目前，文獻報道的前處理方法主要以固相萃取（solid phase extraction，SPE）[2-5]和液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）[6]為主，其他的輔助方法有薄層析（thin-layer chromatography，TLC）和超臨界萃取（supercritical fluid extraction，SFE）等[7]。測定方法主要以高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）-紫外檢測和液質聯用（liquid chromatography - mass spectrometry，LCMS）為主[8-11]，其主要是檢測單一農藥，混合農藥的檢測鮮有報道[2，8]。本試驗選擇7 種磺酰脲類除草劑作為檢測對象，建立其HPLC-紫外檢測分析法，并對測試條件進行詳細的考察。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AKTApurifier 液相色譜儀：通用電氣（中國）醫療集團；SL252 型電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；TGL-16B 型高速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀：北京同泰聯科技發展有限公司；CXW-170 吸油煙機：中山市黃圃鎮澳洲廚具電器廠；眾愛多功能食品料理機：上海眾愛電器有限公司；KQ-250 型超聲波清洗器：昆明市淀山湖檢測儀器廠；ASH-1200-C 型艾科浦超純水機：重慶頤洋企業發展有限公司；Supelco 固相萃取裝置：北京康林科技有限責任公司。

除草劑標準：甲磺隆、苯磺隆、吡嘧磺隆，丙苯磺隆、甲磺胺磺隆（純度均高于97.5%）：德國DR 公司；氯磺隆、芐嘧磺隆（純度均高于97.5%）：Sigma 公司。

除草劑標準儲備液：分別準確稱取上述7 種除草劑標準品，用甲醇溶解配成濃度為1.00 mg/mL 標準儲備液，置于-20 ℃冰箱中保存。

乙腈（色譜純）：德國Merk 公司；甲醇（色譜純）、鹽酸（優級純）：天津市大茂化學試劑廠。

樣品：大豆、玉米、大米，均購于農貿市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil MPC18柱（100A0，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A 相為甲醇-乙腈（體積比 1∶1），B 相為 0.001 mol/L 鹽酸，梯度洗脫程序：0～2CV，B 相為33%→2CV～3CV，B 相為 0%→3CV～4CV，B 相為 33%（CV 表示柱體積；1CV=4.155mL）；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：220、230、240 nm；進樣量：10 μL。

1.2.2 標準曲線的繪制

取一定量各除草劑的標準儲備液，用甲醇逐級稀釋，配制成濃度為 0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、25.00、100.00 μg/mL 的混合標準應用液。進樣 10 μL，以待測除草劑的濃度為橫坐標，其對應的峰面積為縱坐標，繪制出標準曲線或求出線性回歸方程。

1.2.3 樣品采集與處理

大米和玉米樣品：將樣品用勻漿機打碎后，稱取5.0 g 左右，加入20 mL 甲醇，放入超聲波清洗器超聲20 min，取上清液10 mL 氮氣吹干，用1 mL 甲醇溶解殘渣，15 000 r/min 離心5 min 后接進樣測定。

大豆樣品：稱取適量勻漿樣品，加入20 mL 甲醇放入超聲波清洗器超聲20 min，取上清液10 mL 加入已活化好的C18小柱，用5 mL 甲醇分5 次洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干，用1 mL 甲醇溶解殘渣，150 000 r/min離心5 min 后接進樣測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 測定波長的選擇

根據文獻報道，磺酰脲類除草劑通常在210 nm～260 nm 處有吸收峰[12]，考慮到在較低波長下檢測干擾較為嚴重，試驗在220 nm～240 nm 波長進行比較。試驗結果表明，在220 nm 波長處甲磺隆和氯磺隆的靈敏度最高，在230 nm 處甲磺胺磺隆、丙苯磺隆和苯磺隆的靈敏度最高，而在240 nm 處芐嘧磺隆和吡嘧磺隆的靈敏度最高。

2.1.2 流動相的優化

由于磺酰脲類除草劑呈弱酸性，為了能使其能得到較好的峰形，通常在酸性流動相中進行色譜分離[12]。分別用一定比例甲醇-鹽酸水作為流動相進行試驗，氯磺隆與丙苯磺隆不能完全分離。改用一定比例的乙腈-鹽酸水進行色譜分離，苯磺隆與丙苯磺隆不能完全分離。因此，試驗選擇流動相中有機相為乙腈和甲醇混合溶液（體積比1∶1），并在此基礎上考察了有機相和鹽酸水的比例，結果發現，在有機相-鹽酸水體積比為67∶33 時，所有待測除草劑能達到基線分離，但吡嘧磺隆出峰時間太長，超過30 min，因此在其他除草劑出峰完全后，將有機相比例提高至100%進行沖洗，以縮短吡嘧磺隆的保留時間，在此梯度程序下混合標準分離，一次分析在20 min 內可完成。

2.1.3 流速的選擇

高效液相色譜的流速與出峰時間成反比。流速越大，出峰越快，分析周期越短。試驗在0.8 mL/min～1.2 mL/min范圍內考察了流速磺酰脲類除草劑的影響，試驗結果表明：流速在上述范圍內各待測物的分離度均滿足色譜分離的要求，考慮到分析時間和柱壓，試驗選擇1 mL/min流速進行試驗。在上述選擇的最適色譜條件下進行分析，得到混合標準和樣品色譜圖，詳見圖1～圖4。

2.2 樣品處理

由于樣品是顆粒性物質，直接用甲醇或乙腈提取效果較差，所以用勻漿機打碎后再提取，稱取勻漿后的樣品5 g 左右，分別加入20 mL 甲醇和乙腈后用超聲波清洗器超聲萃取20 min，考察了甲醇和乙腈的提取效率，以回收率作為考察指標，結果表明，兩者提取效果相差不大，考慮到甲醇毒性較小且經濟適用，故本次試驗采用甲醇作為提取液。

因樣品中的磺酰脲類除草劑濃度可能較低，因此進行了樣品的濃縮，取甲醇提取液10 mL，氮吹儀吹干后，1 mL 甲醇溶解殘渣，上清液進樣分析。

圖1 混合標準色譜圖Fig.1 Mixed standard chromatogram

圖2 玉米樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of corn sample

圖3 大豆樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of soybean sample

圖4 大米樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of rice sample

按上述提取和濃縮的程序進行樣品處理，結果發現，大米和玉米樣品干擾較少，不影響待測物的分析，而大豆樣品干擾較多，部分干擾物對待測物出峰有影響。因此，用分別用液液萃取和固相萃取小柱對大豆樣品進行了凈化。液液萃取采取在提取液中加入一定量的正己烷進行，固相萃取采取C18小柱進行凈化，比較兩者的凈化效果，結果表明，液液萃取效果遠比C18小柱凈化效果差；在此基礎上，考察了C18小柱的洗脫條件，結果表明，上樣后，直接用甲醇洗脫就能取到明顯的凈化效果。試驗用1 mL～5 mL 甲醇分別進行洗脫，結果發現，用5 mL 甲醇分5 次洗脫后，樣品中的待測物洗脫完全（C18小柱活化：乙腈、甲醇和水各5 mL洗脫）。

2.3 方法指標的考察

2.3.1 線性范圍和檢出限

在優化的分離條件下，配制不同濃度的標準應用液，進樣10 μL 進行測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，所測定的磺酰脲類除草劑在濃度 0.5 μg/mL～100.0 μg/mL 范圍內線性良好（r=0.995 5～0.999 2）；以基線3 倍噪聲對應的標準溶液濃度作為方法的檢出限，結果見表1。

2.3.2 精密度試驗

對同一濃度的標準混合溶液，連續8 次進樣測定，根據保留時間和峰面積的相對標準偏差考察精密度。試驗結果如表2。

表1 磺酰脲類除草劑的線性方程和檢出限Table 1 Linear equation and detection limit of sulfonylurea herbicides

2.3.3 加標回收試驗

分別將玉米與大豆樣品平均分成12 份，其中各3份用于本底值測定，另外每3 份各加入一定量的標準溶液，按照樣品測定步驟進行測定，并計算加標回收率，得到的加標回收率在81.0 %～116.1 %，結果見表3。

表2 標準測定的精密度試驗結果Table 2 Precision test results of standard measurement

表3 加標回收試驗結果Table 3 Spiked recovery experiment results

2.4 樣品的測定

用本文所建立的方法測定了大米、玉米與大豆。大米均未檢出上述7 種除草劑；而玉米檢出了甲磺隆，含量為 7.78 μg/g；大豆檢出了芐嘧磺隆，含量為 10.94 μg/g。

3 結論

綜上所述，本法采用C18小柱固相萃取，高效液相色譜分析了樣品中7 種磺酰脲類除草劑的殘留量，并成功用于實際樣品的檢測。本方法的操作簡便、檢測周期短，20 min 即可完成檢測，適合食品樣品中磺酰脲類除草劑的快速分析。