米糠發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸條件優(yōu)化的研究

劉元，王玥瑋，張立娟

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

米糠中保留了稻米中大部分的營養(yǎng)物質(zhì)，其蛋白 質(zhì)的含量較高，且氨基酸組成豐富，營養(yǎng)全面，尤其是谷氨酸的含量很高[1]。谷氨酸是合成γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric，GABA）的重要原料。

γ-氨基丁酸又名4-氨基丁酸（4-Aminobutanoic acid，4-AB）和γ-氨酪酸，廣泛存在于自然界，由谷氨酸（glutamic acid，Glu）經(jīng)谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，EC 4.1.1.15，簡稱 GAD 或 GDC） 催化而來，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[2]，它參與多種代謝活動，具有重要的生理功能，已報道的生理活性有調(diào)節(jié)血壓、促使精神安定、促進腦部血流、增進腦活力、營養(yǎng)神經(jīng)細胞、增加生長激素分泌、健肝利腎、預防肥胖、促進乙醇代謝（醒酒）、改善更年期綜合癥等多種功效[3-4]。

目前，γ-氨基丁酸（GABA）因其較好的生理功能和應用前景，已受到世界學術和企業(yè)界越來越多的關注和研究。而與國外相比，我國有關GABA 的研究開發(fā)報道較少，有待大力研究開發(fā)。GABA 作為一種新型的功能性因子正越來越引起國內(nèi)人們的關注，對GABA的保健功能和作用機理的進一步深入探討，必將對其應用起到極大的推動作用。

天然存在的GABA 很低，目前制備GABA 的方法主要包括化學合成法和生物合成法，生物合成法又包括植物富集法和微生物發(fā)酵法[1]。在早期研究中，利用大腸桿菌脫羧酶的作用，將L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA，再分離純化得GABA 制品[5]。但利用食用大腸桿菌進行食品開發(fā)存在一些安全方面的問題。Kono 等[6]對koji 制作中GABA 的變化進行了研究，GABA 含量達120 μg/g。乳酸菌己經(jīng)廣泛應用于酸奶、奶酪和泡菜等食品的生產(chǎn)，己經(jīng)有很多研究表明乳酸菌具有GAD 活性，可以催化Glu 脫梭產(chǎn)生GABA[7]。

乳酸菌是具有極強GABA 發(fā)酵能力[8]，且被國際公認的食品安全級微生物，可直接用于食品和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，因此本試驗在傳統(tǒng)的稻谷加工基礎上，結(jié)合現(xiàn)代生物技術對米糠進行深加工，利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA，具有廣闊的市場前景。

1 材料和方法

1.1 材料

米糠：市售；嗜熱鏈球菌S1、保加利亞乳桿菌L1：天津農(nóng)學院提供；GABA 標準品：美國 sigma 公司；CaCl2、硼酸、苯酚、次氯酸鈉、乙醇：天津市大茂化學試劑廠；L－谷氨酸鈉：上海權(quán)旺生物科技有限公司；磷酸吡哆醛：汕頭市西隴化工廠。

1.2 儀器和設備

ESJ205-4 型電子天平：沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；722 可見光分光光度計、DK-98-2 型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；TG18G-II 高速離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；SPX－150B 生化培養(yǎng)箱：天津市華北實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種傳代與活化

參考楊麗麗等[9]和同仲彬等[1]的方法。

1.3.2 新鮮米糠預處理

新鮮米糠在60 ℃、20 min 的條件下進行熱風干燥，之后進行粉碎處理，并過60 目篩。篩下物按照料液比1∶10（g/mL）的比例加入由蒸餾水配置的含0.10 mmol/L 磷酸吡哆醛及1.5 mmol/L CaCl2的溶液，并添加適量的L－谷氨酸鈉，混合均勻，在115 ℃下滅菌15 min。

1.3.3 GABA 含量的測定

1.3.3.1 標準曲線

準確稱取一定量的GABA 標準品用雙蒸水配制成1 mol/L 的GABA 標準溶液，在做標準曲線的時候準確用雙蒸水稀釋GABA 標準溶液為 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L 有梯度的 GABA 標準溶液。從配制好的梯度標準溶液中分別取出1.0 mL，再依次加入0.2 mol/L 的硼酸緩沖液（pH=9）0.4 mL，6%的重蒸苯酚溶液1 mL，5.25%的次氯酸鈉溶液1.5 mL，在混勻后立即放入沸水中水浴10 min，然后立即取出冰浴5 min，取出加60%的乙醇溶液2 mL，然后在640 nm 處測定溶液的吸光值，并以吸光值為縱坐標，GABA 含量為橫坐標，繪制標準曲線，見圖1。

圖1 GABA 標準曲線Fig.1 GABA standard curve

經(jīng)數(shù)據(jù)分析，其回歸方程為y=0.981 2x+0.006 7，相關系數(shù)R2=0.999 8。

1.3.3.2 發(fā)酵液中GABA 的測定

在測定米糠發(fā)酵液中的GABA 含量時，取一定量的米糠發(fā)酵液在高速離心機以12 000 r/min 離心15 min，然后取1 mL，按照標準曲線測定方法進行米糠發(fā)酵液中GABA 含量的測定。

1.3.4 單因素試驗

考察不同的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、乳酸菌添加量和嗜熱鏈球菌S1 和保加利亞乳桿菌L1 比例對米糠發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量的影響，并確定出各因素的最佳水平。

1.3.4.1 發(fā)酵溫度的確定

在菌種添加量為3%的條件下，用混合乳酸菌（嗜熱鏈球菌S1∶保加利亞乳桿菌L1=1∶1）發(fā)酵米糠，設定發(fā)酵溫度分別為 35、40、45、50、55 ℃，在此條件下發(fā)酵20 h，比色法測發(fā)酵液中GABA 含量，選取最佳發(fā)酵溫度。

1.3.4.2 發(fā)酵時間的確定

在菌種添加量為3%、發(fā)酵液溫度45 ℃的條件下，用混合乳酸菌（嗜熱鏈球菌S1∶保加利亞乳桿菌L1=1∶1）發(fā)酵米糠，分別發(fā)酵 12、16、20、24、28 h，比色法測發(fā)酵液中GABA 含量，選取最佳發(fā)酵時間。

1.3.4.3 乳酸菌添加量的確定

用混合乳酸菌（嗜熱鏈球菌S1∶保加利亞乳桿菌L1=1∶1）發(fā)酵米糠，在發(fā)酵液溫度 45 ℃，菌種的添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%的條件下發(fā)酵20 h，比色法測發(fā)酵液中GABA 含量，選取菌種最佳添加量。

1.3.4.4 嗜熱鏈球菌S1 和保加利亞乳桿菌L1 比例的確定

在發(fā)酵溫度45 ℃、發(fā)酵時間20 h、混合菌種添加量3%、嗜熱鏈球菌S1∶保加利亞乳桿菌L1 分別為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1 的條件下發(fā)酵米糠，比色法測發(fā)酵液中GABA 含量，選取菌種最佳比例。

1.3.5 正交試驗

對于后混合式磨料射流技術仍存在一些問題。后混合磨料系統(tǒng)在加工精度、加工效率、加工能力等方面有待提高;對于后混合式磨料射流的流變特性、流場特性和本構(gòu)方程等各項研究較少,對后混合式磨料射流流過噴嘴、射流與磨料混合、磨料加速、射流與大氣的相互干擾、磨料顆粒沖擊對材料的侵蝕和噴嘴移動速度對材料的體積去除率等也研究的較少。

GABA 發(fā)酵條件正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，采用L9（34）正交試驗對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、乳酸菌添加量、嗜熱鏈球菌S1∶保加利亞乳桿菌L1 4 個因素進行優(yōu)化，以發(fā)酵液中GABA 含量作為最終評價指標，確定發(fā)酵生產(chǎn)GABA的最優(yōu)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對GABA含量的影響

發(fā)酵溫度對GABA 含量的影響見圖2。

由圖2 可知，在35 ℃～55 ℃時，發(fā)酵液中GABA的含量先增加后降低，當溫度上升到45 ℃時，GABA含量達到最大值，當溫度大于45 ℃時GABA 含量明顯降低，所以在45 ℃時，發(fā)酵液中GABA 含量較高，即為發(fā)酵的最適溫度。

圖2 發(fā)酵溫度對GABA 含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the content of GABA

2.2 發(fā)酵時間對GABA含量的影響

發(fā)酵時間對GABA 含量的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對GABA 含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the content of GABA

由圖3 可知，隨發(fā)酵時間延長發(fā)酵液中GABA 含量呈先增加后減小的趨勢，這可能是因為谷氨酸脫羧酶催化L-谷氨酸鈉脫羧反應，使發(fā)酵pH 升高不利于生成GABA，且利于GABA 分解為琥珀酸和谷氨酸，與GABA 分解有關的酶是琥珀酸半醛脫氫酶和GABA 轉(zhuǎn)氨酶，其最適pH 偏堿性。發(fā)酵24 h 時GABA 含量達到最大。

2.3 乳酸菌添加量對GABA含量的影響

乳酸菌添加量對GABA 含量的影響見圖4。

圖4 乳酸菌添加量對GABA 含量的影響Fig.4 Effect of adding amount of lactobacillus on the content of GABA

2.4 嗜熱鏈球菌S1和保加利亞乳桿菌L1比例對GABA含量的影響

嗜熱鏈球菌S1 和保加利亞乳桿菌L1 比例對GABA 含量的影響見圖5。

圖5 嗜熱鏈球菌S1 和保加利亞乳桿菌L1 比例對GABA 含量的影響Fig.5 Effect of proportion of Streptococcus thermophilus S1 and Bulgaria Lactobacillus L1 on the content of GABA

由圖5 可知，嗜熱鏈球菌S1∶保加利亞乳桿菌L1為1∶2 時GABA 含量達到最大，因此混合菌種的最佳比例為，嗜熱鏈球菌S1∶保加利亞乳桿菌L1=1∶2。

2.5 正交試驗

正交試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Result of experiment

由表2 可知：4 個因素對GABA 含量影響的重要性依次為C 乳酸菌添加量＞D 嗜熱鏈球菌S1∶保加利亞乳桿菌L1＞A 發(fā)酵溫度＞B 發(fā)酵時間。通過對比可以分別得到各因素最佳水平即理論優(yōu)化發(fā)酵條件為：乳酸菌添加量3%、發(fā)酵溫度48 ℃、嗜熱鏈球菌S1∶保加利亞乳桿菌L1=1∶2、發(fā)酵時間24 h。在此條件下GABA 含量最高，為 320.61（mg/100 g）。

方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Result of variance analysis

由表3 可知：乳酸菌添加量對GABA 含量具有顯著的影響，其影響在4 個因素中相對最大。

3 結(jié)論

本試驗以米糠為原料為原料，利用混合乳酸菌對其進行發(fā)酵生產(chǎn)GABA。通過單因素及正交試驗確定了最佳發(fā)酵工藝，即乳酸菌添加量3 %、發(fā)酵溫度48 ℃、嗜熱鏈球菌 S1∶保加利亞乳桿菌 L1=1∶2、發(fā)酵時間24 h。但該方法發(fā)酵生產(chǎn)的GABA 還需進一步精致，課題組將對其精致方法進行進一步研究。