辣木提取物的制備、抗氧化活性及其在飲料中的應用

郭向陽

（茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽合肥230036）

辣木（Moringa oleifera Lam.）又稱鼓槌樹，奇跡之 樹，白花菜目辣木科多年生熱帶落葉喬木，原產印度北部，適宜于熱帶、亞熱帶地區生長[1]，在我國廣東、福建、廣西、云南、臺灣及海南諸省皆有種植，其中云南種植面積和產量最大，占中國辣木市場的三分之二[2]。辣木營養豐富，富含多種氨基酸、礦物質、維生素等人體必需營養成分，含有黃酮等天然活性成分[3-5]，具有降血糖、降脂、降壓、抗炎、抗氧化及增強人體免疫力等功效[5-7]。辣木葉可食用，在印度有上千年的食用歷史，2014年被國家衛生部批準為“新資源食品”。

辣木提取物是以辣木干葉為原料，經醇提或水提取后，過濾，濃縮至一定比例制備的富含辣木風味及營養成分的天然提取物，可作為天然食品添加劑應用于香精香精及食品中。辣木葉中黃酮含量較高，超過5%，是較好的黃酮類化合物的提取來源[8]。黃酮具有很強的抗氧化和消除自由基作用，既是藥理因子，又是重要的營養因子，是一種新型的營養素，對人體具有重要的生理保健功效，在甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑中具有良好的溶解性[9]。辣木提取物的制備，可以以黃酮的得率作為優化指標，既保留辣木的獨特風味，又可最大化的提取活性成分黃酮，增加營養價值，同時采用食用酒精作為提取溶劑，避免有毒試劑的危害，增加其可食用性和天然性，擴大應用領域，提高辣木原料的利用率，使其可作為食品、藥材、添加劑等在增進營養、食療保健、醫藥養生及香精香料方面得到廣泛應用。但辣木的種植在國內起步較晚，對其食用價值及藥理作用的認知相對較少，其食用性及營養價值亦不被消費者熟知，關于辣木提取物的制備、抗氧化活性分析，以及在飲料中的應用研究，鮮見報道。

本文擬以黃酮提取率，辣木提取物的風味特性作為判定指標，對辣木提取物的制備工藝進行優化，并對其抗氧化活性進行研究，同時對其在飲料中的應用性能進行初步探索。

1 材料與儀器

辣木：采自廣東湛江，白花菜目辣木科辣木樹葉，干燥后粉碎過篩（20 目），備用。

95 %食用酒精、白砂糖、食鹽（氯化鈉）、果葡糖漿、VC、檸檬酸、檸檬酸鈉（均為食用級）、無水乙醇、NaNO2、A（lNO3）3、NaOH（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；蘆丁標準品（色譜級，純度≥98%）、1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

ME104E 分析天平：瑞士梅特勒儀器有限公司；DK-S22 電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；ST16 高速離心機：美國賽默飛世爾科技公司；GM-0.33A 隔膜真空泵：天津市津騰實驗設備有限公司；R-210 旋轉蒸發儀：瑞士步琦公司；UV-2450 紫外可見分光光度計：日本島津儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 辣木提取物制備

準確稱取辣木樣品50 g 置于500 mL 燒杯中，以一定液料比向燒杯中加入不同濃度的食用酒精，混合均勻后，燒杯口上端連接球形冷凝管，經保鮮膜密封燒杯缺口，于一定溫度下（恒溫水浴鍋）浸提一定時間，取出樣品迅速冷卻至室溫（25 ℃）后抽濾，濾液備用；收集濾渣于燒杯中，依試驗設計需要，以上述參數重復浸提，抽濾，合并數次濾液，經旋轉蒸發儀濃縮至原料質量的 1 倍，離心（8 500 r/min，15 min）后收集上清，回填旋蒸冷凝液至50 g，得辣木提取物樣品，4 ℃冷藏備用。辣木提取物中黃酮含量的測定采用鋁絡合分光光度法，以蘆丁作為黃酮對應標準品建立標準曲線進行定量。每組提取試驗進行3 次重復，采用單因素方差分析進行數據顯著性統計分析，以p＜0.05 作為數據顯著性指標。

2.2 黃酮定量標準曲線的建立

準確稱取蘆丁標準品0.050 g，用無水乙醇溶解，定容至50 mL，配制成1 mg/mL 的蘆丁標準液備用[10]。

準確吸取蘆丁標準液 0、10、30、50、100、150、200 μL于10 mL 容量瓶中，再分別加入0.2 mL 5%NaNO2溶液，搖勻，放置5 min 后加入0.2 mL 10%Al（NO3）3溶液，5 min 后再加入 2.5 mL 1 mol/L 的 NaOH 溶液，混勻，加入無水乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min 后，以無水乙醇做空白對照，于510 nm 處測定其吸光度，以蘆丁濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準溶液質量濃度與吸光值的回歸曲線，得到回歸方程為y=0.033 6x+0.003 2（x 為蘆丁濃度，范圍為1 μg/mL＜x＜30 μg/mL，y 為吸光度），R2=0.998 5，如圖 1所示。

圖1 黃酮含量的標準曲線Fig.1 Standard curve of flavonoid content

2.3 辣木提取物黃酮含量的測定

吸取1 mL 辣木提取物于10 mL 的容量瓶定容，依2.2 法所示于510 nm 處測定吸光度，通過回歸方程和稀釋倍數計算辣木提取物中的黃酮含量，計算方法如下：

2.4 辣木提取物抗氧化活性研究

準確稱取0.004 g DPPH，無水乙醇溶解后定容至100 mL，配制成0.1 mmol/L 的DPPH 自由基工作液備用[8-9]。

以優化制備的辣木提取物為供試原料，無水乙醇溶解后制成不同濃度梯度（0.01、0.02、0.03、0.10、0.20、0.33、1.00、10.00 mg/mL）的樣品，然后吸取 0.2 mL 不同濃度的辣木提取物加入到2.8 mL DPPH 自由基工作液，避光反應30 min，在517 nm 波長處測定吸光值，計算其清除率。試驗重復3 次。

式中：A0為空白；Ai為樣品反應體系；Aj為反應前提取液樣品。

2.5 辣木提取物在飲料中的應用

以優化制備的辣木提取物作為供試原料，對其風味特性進行基礎評價和判斷，而后選取適宜的飲料基礎配方，制取飲料基礎液，添加一定比例辣木提取物于飲料基礎液中，分別從飲料澄清度、口感順滑度、香氣舒適度及風味穩定性等四方面對辣木提取物飲料進行評價。

3 結果與分析

3.1 辣木提取物制備優化

以辣木提取物中黃酮得率為主要指標，兼顧其風味特征，考察提取次數、提取溫度、酒精濃度、液料比和提取時間等因素對辣木提取物的影響，在前期提取物制備經驗基礎上，對提取參數范圍進行擇選，優化辣木提取物的浸提條件。

3.1.1 提取次數對辣木提取物的影響

在提取溫度60℃、酒精濃度60%、液料比10∶1（mL/g）、提取時間 2.5 h 條件下，考察不同提取次數（1、2、3、4）對辣木提取物中黃酮得率的影響。試驗結果如圖2所示。

由圖2 可知：提取次數越多，黃酮的得率越高；但是次數多于3 次時，提高幅度變小，不具有顯著性，同時提取次數越多，增加了色素、生物堿類物質的溶出，降低了辣木提取物的風味特性，加重了后期濃縮的負擔，亦導致濃縮過程中風味物質的過度損失。結合實際生產效率和能耗，提取2 次為宜。

圖2 提取次數對辣木提取物中黃酮得率的影響Fig.2 Effects of extraction times on flavonoid content in Moringa oleifera extracts

3.1.2 提取溫度對辣木提取物的影響

在浸提 2 次、酒精濃度 60%、液料比 10∶1（mL/g）、提取時間2.5 h 條件下，考察不同提取溫度（25、30、40、50、60 ℃）對辣木提取物中黃酮得率的影響。試驗結果如圖3 所示。

圖3 提取溫度對辣木提取物中黃酮得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on flavonoid content in Moringa oleifera extracts

由圖3 可知：提取溫度為40 ℃時，黃酮的得率最高。隨著提取溫度的升高，黃酮從基質中溶出的速度增加，黃酮的得率也逐漸增加，但40 ℃以后，相對高的溫度會導致體系中其它非揮發性物質的溶出，同時可能導致黃酮結構的改變，因此其得率呈下降趨勢，而且在中低溫度下，辣木提取物具相對真實的風味特征，不具有高溫下的蒸煮味等不良風味。結合產品特性及生產的實際情況，節省能耗，提取溫度設置為40 ℃。

3.1.3 酒精濃度對辣木提取物的影響

在提取 2 次、提取溫度 40 ℃、液料比 10∶1（mL/g）、浸提時間2.5 h 條件下，考察不同酒精濃度（0、20、40、60、80、95%）對辣木提取物中黃酮得率的影響。

圖4 酒精濃度對辣木提取物中黃酮得率的影響Fig.4 Effects of ethanol concentration on flavonoid content in Moringa oleifera extracts

圖4 所示，酒精濃度在20%～40%時，黃酮的得率有最高值。黃酮難溶于水，易溶于酒精，隨著酒精濃度的增加，增加了黃酮在溶劑中的溶解性，黃酮的得率呈上升趨勢，但隨著酒精濃度的繼續增大，會加大其它脂溶性物質的溶出，形成競爭性提取，而導致黃酮得率的降低。同時高酒精濃度下的辣木提取物，醇味過于透發，在頭香中聚集，而且酒精易揮發的特性易帶走提取物中的部分揮發性成分，造成風味損失，不利于貯存和運輸。實際生產中，建議酒精濃度為30%。

3.1.4 液料比對辣木提取物的影響

在提取2 次、提取溫度40 ℃、酒精濃度30%、浸提時間 2.5 h 條件下，考察不同液料比[2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1（mL/g）]對辣木提取物中黃酮得率的影響。實驗結果如圖5 所示。

圖5 液料比對辣木提取物中黃酮得率的影響Fig.5 Effects of liquid to material ratio on flavonoid content in Moringa oleifera extracts

由圖5 可知，黃酮的得率隨著提取溶劑量的增加，先升高后下降。隨著提取溶劑量的增加，增大了黃酮在介質中的溶出速度，其得率逐漸增大，在液料比為8∶1（mL/g）時，黃酮得率最高，而后降低，可能是隨著提取溶劑量的增加，單位體積內黃酮的量逐漸減少，傳質的速度變慢或降低所致。在液料比為6∶1（mL/g）至 8∶1（mL/g）過程中，黃酮得率增加相對緩慢，兩者風味無明顯差異，因此在實際生產中，考慮到能耗、生產成本及生產實際，選取液料比為6∶1（mL/g）。

3.1.5 浸提時間對辣木提取物的影響

工科新教師培訓實踐偏離的原因較為復雜，既有學校政策制度的影響又有學校管理體制與機制的制約，既有新教師個體培訓動力不足又有培訓組織實施不到位等原因。

在提取2 次、提取溫度40 ℃、酒精濃度30%、液料比 6∶1（mL/g）條件下，考察不同提取時間（1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h）對辣木提取物中黃酮得率的影響，如圖6 所示。

圖6 提取時間對辣木提取物中黃酮得率的影響Fig.6 Effects of extraction time on flavonoid content in Moringa oleifera extracts

由圖6 可知，黃酮的得率隨著提取時間的延長而逐漸升高，提取時間大于2 h，升高速度變緩。2 h～3 h對辣木黃酮的提取相對完全，時間過長易導致辣木提取物中蒸煮味的產生，綜合考慮提取效率、生產效益，以及風味特性，選取提取時間為2 h。

綜合以上優化因素，辣木提取物的提取條件為：40 ℃的提取溫度下，6∶1（mL/g）的液料比，以 30%的食用酒精作為提取溶劑，提取2 次，每次提取2 h。在此條件下制備辣木提取物，并進行驗證試驗。3 次提取的辣木提取物中黃酮得率的平均值為（5.79±0.03）%，高于優化中的各組，同時提取物中辣木特征風味凸出，醇味較輕，無蒸煮味，風味特性較好。

3.2 辣木提取物的抗氧化活性分析

將優化后制備的辣木提取物作為供試原料，利用DPPH 法研究其體外清除DPPH 自由基的能力，對其抗氧化活性進行初步研究。辣木提取物的濃度與DPPH 自由基清除率通過方程擬合得到的擬合曲線及擬合方程見圖7。

通過上圖擬合方程，得到辣木提取物清除DPPH自由基的EC50=0.46 mg/mL。由此可見，辣木提取物具有極強的清除DPPH 自由基的能力，具有較強的抗氧化活性[11]，可作為潛在的抗氧化劑使用。

圖7 辣木提取物黃酮含量對DPPH 自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of flavonoids from Moringa oleifera extracts on DPPH free radical

3.3 辣木提取物飲料應用

鮮嫩辣木葉具新鮮的蔬菜風味，青味透，似菠菜口感，具辛辣味，味微苦，直接食用會難以下咽[12]，但優化制備的辣木提取物摒棄了辣木葉的青味，具清香和似茶的風味，微澀而少苦，因此可考慮以茶飲料的基礎配方（35 g 白砂糖，60 g 的果葡糖漿，1.0 g 的檸檬酸，0.2 g 的 VC，0.3 g 的檸檬酸鈉，0.1 g 的食鹽，用純凈水溶解完全，定容至1 L）進行辣木提取物飲料的適配和調制。

表1 辣木提取物飲料的感官評價Table 1 Sensory evaluation of moringa extracts beverage

經過8 位專業飲料研發人員的感官評價，綜合各評價指標及2 h 風味穩定性結果，0.5%的辣木提取物添加到茶飲料基礎液中，能獲得有厚度，滋味鮮爽而回甘，具順滑口感、柔和的清香和葉香的應用產品，且飲料澄清度較好，香氣持久而揚，無絮狀或懸浮顆料出現，0.5%的添加比例較適合，特征風味透發，產品相對穩定。

4 結論與討論

對辣木提取物的制備進行了小試優化，提取溫度40 ℃，液料比 6∶1（mL/g），以 30%的食用酒精作為提取溶劑，提取2 次，每次提取2 h，辣木提取物黃酮得率為（5.79±0.03）%，高于選取的單因素條件下的各組，為工業化中試生產提供參數借鑒和參考，在此條件下制備的辣木提取物具柔和的清香和葉香，鮮而微澀，有回甘，醇味較淡，但提取物有苦澀感，微腥而具青味，可能與其中含有的生物堿類、色素類物質有關。利用DPPH 試驗對辣木提取物清除自由基的能力進行了研究，辣木提取物清除DPPH 自由基的EC50=0.46 mg/mL，抗氧化活性較好。同時對辣木提取物在飲料中的應用進行了初探，可以較好的跟茶飲料基礎液進行融合和復配，適制產品具柔和的清香，淡而微鮮爽，澄清透明，穩定性較好，0.5%的添加比例較為合適。后期可對提取物進行純化和精制，最大化的獲取其營養及健康組分，對其苦、澀味進行修正，保留其清香、鮮爽的風味，同時對其在飲料中的應用進行更為細致的研究和探索，為辣木提取物工業化生產及在飲料、保健品方向上的應用提供數據支撐和參考。