玉米粉制備葡萄糖的糖化工藝優化

孟悅，王英哲，田志剛，孫洪蕊，曾憲鵬，楊志強

（吉林省農業科學院，吉林長春130124）

我國是世界上第二大玉米生產國，年產玉米2.15億噸，除飼料工業每年可消耗大量的玉米外，現在我國已經形成了玉米淀粉、酒精、有機酸、淀粉糖等一系列玉米深加工產品，其中淀粉糖是僅次于酒精的第二大玉米深加工產品[1]。但目前國內生產淀粉糖，原料大都采用淀粉，生產成本高，副產品利用率低，造成資源浪費和環境污染。與復雜的濕法玉米淀粉生產技術相比，玉米粉是將干玉米粒通過機械設備，破損、粉碎、過篩等簡單的加工手段而得到一類產品[2]。它資源廣、成本低、不受季節的限制，因此利用玉米粉生產葡萄糖是理想的選擇[3]。

糖化工藝是影響葡萄糖轉化率、葡萄糖質量以及生產周期的關鍵環節。糖化酶的主要作用是從淀粉、糊精、糖原等碳鏈上的非還原性末端依次水解α-1，4糖苷鍵，較快速度切下一個個葡萄糖單元，將原料水解成葡萄糖[4]。以玉米粉為原料生產葡萄糖雖然可以降低生產成本，節能節水，但要實現工業化生產也存在諸多技術問題需要解決，玉米經脫胚后，雖然蛋白質和脂肪含量均有所降低，但仍然比玉米淀粉中的蛋白質和脂肪高出許多倍，因此影響了糖化液的物理性質，同時也影響了酶觸反應效率。為了提高玉米粉液化液的糖化效率，本研究根據現有的淀粉糖化條件進行了玉米粉糖化條件優化試驗，確定了玉米粉糖化最佳條件，制備的糖化液質量好，DX 值高。生產方法簡單可行，而且降低成本，減少環境污染，為以玉米粉為原料生產葡萄糖提供了可靠依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉：山東省德州市武城縣綠源農副產品加工廠，過80 目篩備用，水分質量分數11.84%；無水葡萄糖：西隴科學有限公司；酒石酸鉀鈉：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉、硫酸銅、鹽酸均為分析純：北京化工廠；耐高溫α-淀粉酶（酶活力70 000 U/mL）、葡萄糖淀粉酶（酶活力110 000 U/mL）：寧夏夏盛實業集團有限公司。

1.2 儀器設備

ME204E 型電子分析天平：德國梅特勒-托利多儀器有限公司；PHS-3C 型精密pH 計：上海雷磁儀器有限公司；WAY-3S 型數字阿貝折射儀：上海儀電科學儀器股份有限公司；HH-ZKYY-5L 型恒溫水浴鍋：上?？粕齼x器有限公司；JY10002 型電子秤：良平儀器有限公司；1260Infinity 型高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；蒸發光散射檢測器：美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

過篩玉米粉→調漿→液化→調pH 值→加熱→糖化→過濾→精制→真空濃縮→葡萄糖漿[5]

1.3.2 玉米粉制備葡萄糖糖化工藝單因素試驗

1.3.2.1 糖化溫度對糖化液DE值和DX值的影響

玉米粉漿質量分數為25%，經液化后在pH 值為4.3，糖化時間為12 h，葡萄糖淀粉酶添加量為36 U/g時的試驗條件下，考察不同糖化溫度45、50、55、60、65 ℃對糖化工藝的影響程度，分析不同的糖化溫度對DE 值和DX 值的影響，以確定適宜的糖化溫度范圍[6]

1.3.2.2 糖化時間對糖化液DE值和DX值的影響

玉米粉漿質量分數為25%，經液化后在糖化溫度為60 ℃，pH 值為4.3，葡萄糖淀粉酶添加量為36 U/g時的試驗條件下，考察糖化時間 2、4、6、8、10、12、14 h對糖化工藝的影響程度，分析不同的糖化時間對DE值和DX 值的影響，以確定適宜的糖化時間范圍。

1.3.2.3 pH 值對糖化液DE 值和DX 值的影響

玉米粉漿質量分數為25 %，經液化后在糖化溫度為60 ℃，糖化時間為12 h，葡萄糖淀粉酶添加量為36 U/g 時的試驗條件下，考察不同pH 值3.3、3.8、4.3、4.8、5.3 對糖化工藝的影響程度，分析不同的pH 值對DE 值和DX 值的影響，以確定適宜的pH 值范圍[7]。

1.3.2.4 葡萄糖淀粉酶添加量對糖化液DE 值和DX值的影響

玉米粉漿質量分數為25%，經液化后在糖化溫度為60 ℃，糖化時間為12 h，pH 值為4.3 時的試驗條件下，考察不同葡萄糖淀粉酶添加量 9、18、27、36、45、54 U/g 對糖化工藝的影響程度，分析不同的葡萄糖淀粉酶添加量對DE 值和DX 值的影響，以確定適宜的葡萄糖淀粉酶添加量范圍[8]。

1.3.3 正交試驗設計優化糖化工藝參數

根據單因素試驗的結果分析，選取糖化溫度、糖化時間、pH 值、葡萄糖淀粉酶添加量4 個因素的較優水平范圍，以DE 值和DX 值為指標，設計L9（34）正交試驗方案，因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.3.4 原料玉米粉水分測定方法

參照GB/T5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》。

1.3.5 DE 值檢測方法

DE 值是指糖液中還原糖（以葡萄糖計）占干物質的百分率，以費林試劑法測定樣品中還原糖的含量，參照GB/T5009.7-2008《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》。

1.3.6 DX 值檢測方法

利用高效液相色譜儀，蒸發光散射檢測器檢測糖化液中的葡萄糖含量，色譜條件為：Benson800BP-100鈣型陽離子色譜柱4.6 mm×250 mm，流動相使用超純水，氮氣為載氣，柱溫箱設定在80 ℃，進樣量10 μL，流速為1 mL/min，將糖化液稀釋至一定的質量分數，再經過0.2 μm 膜過濾，收集濾液進行高效液相檢測，通過比較標準品與糖化液組分峰的保留時間進行定性分析，利用面積歸一法和線性回歸方程定量計算DX 值[9]。

葡萄糖標準曲線繪制：制備 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的標準葡萄糖溶液，按上述液相條件進行檢測，得到峰面積。以葡萄糖濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線見圖1[10]，計算得線性回歸方程為y=2 049.8x+6.192 9，線性相關系數0.999 3，具體樣品檢測參照GB/T20880-2018《食用葡萄糖》。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2 結果與分析

2.1 糖化溫度對糖化液DE 值和DX 值的影響

糖化溫度對糖化液DE 值和DX 值的影響見圖2。

圖2 糖化溫度對DE 值和DX 值的影響Fig.2 Effect of saccharification temperature on DE value and value DX value

由圖2 可以看出，隨著糖化溫度的不斷升高，DE值和DX 值先是增大，到了60 ℃以后開始緩慢下降，這是由于葡萄糖酶活性與溫度密切相關，酶制劑和化學催化劑一樣隨著溫度升高，酶解反應速率升高，但酶制劑是一種蛋白質，隨著溫度過高其活性降低[11-13]，只有溫度在60 ℃左右時，是該糖化酶最適作用溫度范圍。當溫度超過60 ℃后，酶活力下降，酶活性被抑制，從而使糖化效果變差。隨著糖化溫度的不斷升高，通過高效液相檢測的DX 值在60 ℃時達到了95.21%。說明糖化溫度對糖化效果影響較為顯著。綜合考慮兩項指標，糖化溫度的適宜溫度范圍在60 ℃左右。

2.2 糖化時間對糖化液DE值和DX值的影響

糖化時間對糖化液DE 值和DX 值的影響見圖3。

圖3 糖化時間對DE 值和DX 值的影響Fig.3 Effect of saccharification time on DE value and DX value

由圖3 可以看出，隨著糖化時間的不斷延長，DE值和 DX 值大幅度提高，直到 12 h～16 h 左右，DE 值波動變小，逐漸趨于平穩。且時間再長也無明顯的變化，其原因可能是，糖化酶是一種外切酶，從碳鏈上的非還原性末端依次水解α-1，4 糖苷鍵，較快速度切下一個個葡萄糖單元，開始時水解進行較快，隨著分子鏈變短，水解強度慢慢減弱[14-15]。DX 值也在12 h 時達到96.41%，表示糖化完全，不必再延長時間，浪費資源。綜合考慮兩項指標，糖化時間選擇在8 h～12 h 為宜。

2.3 pH值對糖化液DE值和DX值的影響

pH 值對糖化液DE 值和DX 值的影響見圖4。

圖4 pH 值對DE 值和DX 值的影響Fig.4 The effect of pH value on DE value and DX value

由圖 4 可以看出，pH 值從 3.3 增大到 4.3 時，DE值和DX 值呈逐漸上升的趨勢，并在4.3 時達到了最大值，從4.3 到5.3 時，DE 值呈逐漸下降的趨勢。DX值隨pH 值的增高呈現了先增大后減小的趨勢。由于pH 值對糖化效果影響較大，每種酶都有最適的pH值，過高或過低，都會影響酶分子與底物的結合和催化能力，影響酶的活性[16-17]。綜合考慮pH 值選取在4.3～5.3 之間為宜。

2.4 葡萄糖淀粉酶添加量對糖化液DE值和DX值的影響

葡萄糖淀粉酶添加量對糖化液DE 值和DX 值的影響見圖5。

圖5 酶添加量對DE 值和DX 值的影響Fig.5 The effect of enzymatic dosage on DE value and DX value

由圖5 可以看出，葡萄糖淀粉酶添加量對DE 值和 DX 值影響較大，添加量為 9 U/g～36 U/g 時，DE 值從55.97%迅速增大到95.22%，過了36 U/g 后，DE 值開始呈現下降趨勢，是因為底物濃度一定時，葡萄糖淀粉酶濃度在添加36 U/g 后達到飽和，繼續增加也不會再促進DE 值的升高，如果繼續添加淀粉酶，會造成不必要的浪費，增加生產成本[18]。DX 值也在酶添加量的影響下呈現先升高后降低的趨勢，與DE 值基本一致。因此選擇葡萄糖淀粉酶添加量為27 U/g～45 U/g 為宜。

2.5 正交試驗優化糖化工藝參數的結果與分析

在單因素試驗的基礎上，進行L9（34）正交試驗，重點考察糖化溫度、糖化時間、pH 值、葡萄糖淀粉酶添加量4 個因素對玉米粉糖化程度的影響，結果見表2，DE值平均值和極差以小寫表示，DX 值平均值和極差以大寫表示[19]。

表2 正交試驗設計與結果Table 2 The design and results of orthogonal experiment

從表2 的極差分析結果可以看出：對糖化DE 值的影響順序為A＞B＞D＞C，即糖化溫度＞糖化時間＞酶添加量＞pH 值，最優組合為A2B3C1D3，即糖化溫度60 ℃，糖化時間12 h，pH4.3，酶添加量45 U/g。對DX 值的影響順序為A＞B＞D＞C，即糖化溫度＞糖化時間＞酶添加量＞pH，最優組合為A2B3C3D3，即糖化溫度60 ℃，糖化時間 12 h，pH5.3，酶添加量 45 U/g。

正交試驗方差分析見表3。

表3 正交試驗方差分析Table 3 Analysis of variance for orthogonal

在極差分析的基礎上，采用方差分析方法對各因素的顯著性進行分析，從表3 中看出，糖化溫度對DE值和DX 值的影響達到了顯著水平，糖化時間對DE值，酶添加量對DX 值都達到了極顯著水平[20]。因此在玉米粉生產葡萄糖糖化液時，糖化溫度、糖化時間和糖化酶添加量這3 個因素都要考慮[21-22]。

驗證試驗：將兩組優化參數進行驗證試驗，在A2B3C1D3條件下 DE 值為 98.86%，DX 值為 97.68%。在A2B3C3D3條件下 DE 值為 98.24 %，DX 值為 98.16 %。在實際生產中，主要是以葡萄糖含量（DX 值）作為主要指標，是直接反應糖化效果好壞的重要參數[23-24]，是葡萄糖得率的重要指標，DX 值高則代表糖化效果越好，葡萄糖得率高[25]，所以最后選擇A2B3C3D3即糖化溫度60 ℃，糖化時間12 h，pH 值5.3，葡萄糖淀粉酶添加量45 U/g 為糖化工藝的最佳條件。

3 結論

以玉米粉為原料，在葡萄糖淀粉酶的作用下，通過單因素對糖化DE 值和DX 值的影響，根據單因素試驗結果設計正交試驗進行優化。最佳糖化工藝水平參數：糖化溫度60 ℃，糖化時間12 h，糖化pH 5.3，葡萄糖淀粉酶添加量45 U/g。試驗制備的玉米粉糖化液質量好，玉米蛋白質絮凝好，固液分層明顯，糖液澄清度高，此工藝不僅提高了玉米粉制備葡萄糖的得率，而且為以后的實際生產提供了可靠的理論依據。