銀耳多糖乙酰化修飾及其抗氧化活性

徐兵，陸灝鈺，徐倩，陳義勇

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟215500）

銀耳（Tremella fuciformis）又名白木耳，含有酚類、黃酮類及膳食纖維等[1]物質，銀耳多糖（polysaccharides from Tremella fuciformis，TFP）是銀耳的主要活性成分[2]，近年來，國內外研究發現，銀耳多糖具有免疫調節[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、降血糖[6]等功能，分子修飾對多糖活性有很大的影響[7]。至今已發現多糖的活性與其結構有著密切的關系，經過乙酰化修飾的多糖水溶性增加，生物活性得到明顯的增強[8]。然而目前，銀耳多糖的修飾主要集中在磷酸化[9]、硫酸化[10]等方面，對銀耳多糖乙酰化修飾工藝的研究尚未見報道。為了進一步研究銀耳多糖乙酰化修飾及其抗氧化活性，本文研究了乙酸酐用量、反應時間和反應溫度對TFP 乙酰化反應的影響，并利用響應面法對TEP 乙酰化化修飾工藝條件進行優化，同時探討采用IC50法（自由基清除率）測定乙酰化銀耳多糖（acetylated polysaccharides from Tremella fuciformis，Ac-TFP）的抗氧化活性。旨在為乙酰化銀耳多糖的工業化制備奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

銀耳：市售；1，1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH）：上海楷陽生物技術有限公司；三羥甲基氨基甲烷（trihydroxymethyl aminomethane，Tris）：上海楷陽生物技術有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、乙酸酐、鹽酸、過氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、酚酞、鄰苯三酚等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DJ-04 粉碎機：上海淀久中藥機械制造有限公司；HH-2 智能數顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機：日本HITACHI 公司；RE-52A 型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器有限公司；Alpha 1-2 LD 冷凍干燥機：德國 CHRIST 公司；ME104E 型分析天平、FE20 型 pH 計：瑞士 METTLER TOLEDO 公司。

1.3 方法

1.3.1 銀耳多糖的制備

銀耳經過干燥，然后機械粉碎，并過60 目篩，獲得銀耳粉。將銀耳粉末與蒸餾水按照料液比1∶50（g/mL），90 ℃條件下水浴浸提6 h，浸提液離心（4 500 r/min）10 min，合并上清液。將上清液減壓濃縮至一定體積，加入濃縮后體積的1/4 的Sevage 試劑（正丁醇∶三氯甲烷=1∶4，體積比），攪拌 0.5 h，將其混勻，然后離心（4 500 r/min）10 min，得到上清液，加入4 倍體積的95%的乙醇，在4 ℃條件下醇沉24 h，離心，沉淀冷凍干燥后得到TFP 備用。

1.3.2 乙酰化銀耳多糖（Ac-TFP）的制備

參考宋逍等[11]的方法并適當調整。精確稱取100 mg TFP 樣品，溶解在10 mL 的蒸餾水中，用氫氧化鈉溶液（0.5 mol/L）調節pH 值至9。在30 ℃條件下，向多糖溶液滴加一定量的乙酸酐，滴加完畢后，恒溫反應2 h，待反應結束，用1 mol/mL 的HCl 將反應液的pH 值調至7.0，將反應液裝入截留分子量為15 000 kD 的透析袋中，用蒸餾水透析48 h，透析液經減壓濃縮后，用4 倍體積分數為95%的乙醇醇沉24 h，沉淀冷凍干燥即為乙酰化銀耳多糖（Ac-TFP）。

1.3.3 乙酰化取代度（degree of substitution，DS）的測定

稱取TFP10 mg，溶解在10 mL 的0.01 mol/L 的NaOH 溶液中，以酚酞作為指示劑（1 ～2），并用0.01 mol/L 的HCl 溶液滴定至紅色退去。記錄滴定時的HCl 用量，并按下列公式計算出取代度[12]：

式中：A 為乙酰基含量，%；V0為加入 NaOH 溶液的體積，mL；C0為加入 NaOH 溶液的濃度，mol/L；V1為消耗 HCl 溶液的體積，mL；C1為 HCl 溶液的濃度，mol/L；m為樣品質量，g。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 乙酸酐用量對TFP 乙酰化反應的影響

精確稱取100 mg 的TFP，在反應時間3 h，反應溫度 60 ℃的條件下，探討乙酸酐用量（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL）對TFP 乙酰化反應的影響，確定最佳乙酸酐用量。

1.3.4.2 反應時間對TFP 乙酰化反應的影響

精確稱取100 mg 的TFP，在乙酸酐用量3.0 mL，反應溫度 60 ℃的條件下，探討反應時間（1、2、3、4、5 h）對TFP 乙酰化反應的影響，確定最佳反應時間。

1.3.4.3 反應溫度對TFP 乙酰化反應的影響

精確稱取100 mg 的TFP，在乙酸酐用量3.0 mL，反應時間 3 h 的條件下，探討反應溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）對TFP 乙酰化反應的影響，確定最佳反應溫度。

1.3.5 響應面試驗設計

根據單因素試驗的結果，通過響應面試驗設計，以取代度值為指標，以反應時間、反應溫度和乙酸酐用量為3 個因素，設計三因素三水平的響應面試驗，優化TFP 乙酰化修飾工藝條件。

1.3.6 Ac-TFP 的結構表征

分別以干燥的 TFP 和 Ac-TFP 粉末與KBr 為1∶1 000 的質量比例進行研磨，充分混勻后壓片，在波長為4 000 cm-1～400 cm-1的范圍下進行紅外光譜掃描，比較TFP 和Ac-TFP 的紅外光譜圖。

1.3.7 抗氧化活性測定

1.3.7.1 ·OH 清除能力測定

分別向試管中加入1 mL 9.0 mmol/L 的FeSO4、1 mL 9.0 mmol/L 的水楊酸乙醇溶液，搖勻，然后分別加入1 mL 的不同濃度的修飾后的 Ac-TFP 溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L） 和 1 mL 不同濃度的修飾前的 TFP 溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L），充分混勻后，加入 1 mL 8.8 mmol/L 的 H2O2，混勻，置于 37 ℃水浴鍋中水浴30 min 進行反應，以蒸餾水作為參比，在波長為510 nm處測定各反應溶液的吸光度值Ai。空白對照組以相同體積蒸餾水替代多糖樣品測吸光度值。并按照下列公式進行計算·OH 的清除率[13]。

式中：Ai為不同濃度TFP 和Ac-TFP 的吸光度值；Aj為水楊酸以蒸餾水為替代物的吸光度值；A0為不同濃度TFP 和Ac-TFP 以蒸餾水為替代物的吸光度值。

1.3.7.2 DPPH 自由基清除能力測定

分別將2 mL 的不同濃度的TFP 和Ac-TFP 溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L） 和 2 mL 濃度為 0.1 mmol/L的DPPH 溶液振蕩搖勻，搖勻后于25 ℃左右下避光反應30 min，在波長為517 nm 處測定吸光度值，并按照下列公式進行計算DPPH 自由基的清除率[14]。

式中：A2為不同濃度TFP 和Ac-TFP 的吸光度值；A1為不同濃度TFP 和Ac-TFP 以蒸餾水為替代物的吸光度值；A0為DPPH 以蒸餾水為替代物的吸光度值。

1.3.7.3 O2-·清除能力測定

在試管中加入 4.5 mL 的 Tris-HCl 緩沖液（50 mmol/L，pH8.2）、1 mL 不同濃度的 TFP 和 Ac-TFP溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）及 3.2 mL 蒸餾水，搖勻后在25 ℃的水浴鍋中水浴20 min，再加入0.3 mL 的7 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，置于25 ℃的水浴鍋中反應3 min，隨即用10 mol/L 的HCl 溶液終止反應，并在波長為325 nm 處測定吸光度值為A。空白對照組以蒸餾水代替多糖樣品，測得的吸光度值為A0。并按照下列公式計算O2-·的清除率[15]。

式中：A 為不同濃度TFP 和Ac-TFP 的吸光度值；A0為不同濃度TFP 和Ac-TFP 以蒸餾水為替代物的吸光度值。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙酸酐用量對TFP 乙酰化反應的影響

乙酸酐的用量對TFP 乙酰化反應的影響見圖1。

從圖1 中可知，TFP 乙酰基的取代度先是呈上升趨勢，在乙酸酐用量為3 mL 時，達到最大值，繼續增加乙酸酐的用量，TFP 乙酰基的取代度開始下降。這可能是因為隨著乙酸酐用量的增多，增加了TFP 乙酰化反應的幾率，乙酰基取代度隨之增大，但是當乙酸酐的用量過多時，增大了乙酸酐水解的副反應程度，反應體系的pH 值逐漸下降，從而導致TFP 乙酰基的取代度逐漸下降。

圖1 乙酸酐用量對TFP 乙酰基取代度的影響Fig.1 Effect of acetic anhydride amount on substitution degree of Ac-TFP

2.1.2 反應時間對TFP 乙酰化反應的影響

反應時間對TFP 乙酰化反應的影響見圖2。

圖2 反應時間對TFP 乙酰基取代度的影響Fig.2 Effect of reaction time on substitution degree of Ac-TFP

從圖2 中可知，TFP 乙酰基的取代度隨著反應時間的增加而增大，但是在反應時間超過2 h 之后，繼續延長反應時間，TFP 乙酰基取代度迅速降低，這可能是因為Ac-TFP 產物在體系中并不穩定，隨著反應時間的延長，增加了反應物之間的碰撞幾率，部分產物發生了分解，引起乙酰化程度降低。

2.1.3 反應溫度對TFP 乙酰化反應的影響

反應溫度對TFP 乙酰化反應的影響見圖3。

由圖3 可知，在 30 ℃～60 ℃的溫度范圍內，TFP 乙酰基取代度逐漸增大，在反應溫度超過60 ℃，TFP 乙酰基的取代度開始變小。可能是因為在一定的溫度范圍內，反應溫度越高，反應物的活性就會越強，TFP 乙酰基的取代度就隨之增大，但當溫度超過60 ℃時，由于乙酸酐的水解速度過快，進而導致TFP 乙酰基的取代度相應減小。

圖3 反應溫度對TFP 乙酰基取代度的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on substitution degree of Ac-TFP

2.2 TFP乙酰化工藝條件優化

2.2.1 響應模型的建立

在單因素試驗結果的基礎上，以乙酰基取代度為指標，設計以反應時間（A）、反應溫度（B）和乙酸酐用量（C）三因素的回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，試驗因素和水平設計見表1，響應面試驗設計方案及結果見表2，響應面分析得出的回歸模型參數方差分析見表3。

表1 響應面試驗因素與水平設計表Table 1 Factors and levels designed for response surface analysis

表2 響應面試驗結果Table 2 Experimental results for response surface analysis

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial mode

利用Design-Expert 軟件對表2 中的試驗結果進行二次方程擬合，得到TFP 對反應時間（A）、反應溫度（B）和乙酸酐用量（C）與乙酰基取代度（Y）之間的二次多項回歸方程的模型為：

Y=0.43-0.089A-0.001B-0.018C-0.006 75AB-0.015AC-0.038BC-0.093A2-0.048B2-0.06C2

表3 中的數據顯示，F 值為 44.96，P＜0.000 1，結果為二次多項回歸方差的模型極顯著，失擬誤差的P 值為0.095 6，大于0.05，結果為不顯著，則表明建模成功。擬合得到的二次多項回歸方程系數R2=0.983 0，證明建模可信度較高。

表3 的方差分析結果中還可看出，試驗組合中的各因素中，A 和C 的P 值都小于0.05，即反應時間和乙酸酐用量對Ac-TFP 乙酰基取代度的影響顯著，并且時間因素的影響最為顯著，3 個因素對Ac-TFP 乙酰基取代度的影響大小為：反應時間（A）＞乙酸酐用量（C）＞反應溫度（B）。

2.2.2 TFP 乙酰化修飾響應面分析

反應時間和反應溫度對TFP 乙酰基取代度的影響效果見圖4。

由圖4 可知，相較于反應溫度，反應時間的影響更顯著，曲線更陡，等高線更密集。反應時間和乙酸酐用量對TFP 乙酰基取代度的影響效果見圖5。

由圖5 可知，相較于乙酸酐用量，反應時間對TFP乙酰基取代度的影響效果更為顯著，曲線更陡，等高線更密集。反應溫度和乙酸酐用量對TFP 乙酰基取代度的影響效果見圖6。

圖4 反應時間和反應溫度對取代度的影響Fig.4 Effects of reaction time and reaction temperature on substitution degree of Ac-TFP

圖5 反應時間和乙酸酐用量對取代度的影響Fig.5 Effects of reaction time and acetic anhydride amount on substitution degree of Ac-TFP

圖6 反應溫度和乙酸酐用量對取代度的影響Fig.6 Effects of reaction temperature and acetic anhydride amount on substitution degree of Ac-TFP

結果顯示為反應溫度和乙酸酐用量相比較而言，對TFP 乙酰基取代度的影響相差不大，交互影響較為顯著，從曲線陡的程度看來，乙酸酐用量對TFP 乙酰化修飾的影響程度要大于反應溫度對TFP 乙酰化修飾的影響程度。

2.2.3 TFP 乙酰化修飾最佳工藝條件確定及驗證

利用Design-Expert 8.06 軟件對響應面試驗結果進行分析，可預測得到TFP 乙酰化修飾最佳工藝條件為：反應溫度61.04 ℃，反應2.37 h，添加的乙酸酐用量2.89 mL，在該條件下，乙酰化銀耳多糖取代度為0.39。按照此預測條件進行驗證試驗，為使試驗更具有可行性，調整預測工藝條件為：反應時間2.4 h，反應溫度61 ℃以及乙酸酐用量為2.9 mL。重復試驗3 次，得到的DS 值為0.385，與預測值差異很小，證明建立的模型可靠。

2.3 Ac-TFP的結構表征分析

TFP 和Ac-TFP 的紅外光譜圖見圖7。

圖7 TFP 和Ac-TFP 的紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra of TFP and Ac-TFP

TFP 和Ac-TFP 的特征峰與對應的波長和基團振動情況見表4。

表4 TFP 和Ac-TFP 特征峰對應的波長和基團振動情況Table 4 Wave numbers and peaks belong to the Fourier transform infrared（FTIR）spectra of TFP and Ac-TFP

3 416 cm-1左右為糖分子內或分子間氫鍵O-H 伸縮振動峰，2 932cm-1左右為次甲基（-CH2-）中的 C-H 的伸縮振動的吸收峰[16]。修飾后Ac-TFP 在1 727.19 cm-1處出現的吸收峰為酯基C＝O 雙鍵的收縮振動，同時在1 255.27 cm-1處有一個較弱的酯基C-O 的收縮振動[17]，說明乙酰化衍生物中已經成功加入了乙酰基。

2.4 Ac-TFP的抗氧化活性

2.4.1 Ac-TFP 對·OH 清除作用

TFP 和 Ac-TFP 對·OH 的清除作用見圖8。

圖8 TFP 和 Ac-TFP 對·OH 的清除作用Fig.8 Scavenging capacity of TFP and Ac-TFP on hydroxyl free radicals

從圖中8 可以看出，TFP 對·OH 具有較為良好的清除效果。在多糖質量濃度為0.2 mg/mL～1.0 mg/mL時，TFP 和 Ac-TFP 對·OH 的清除能力逐漸變強，尤其是在0.8 mg/mL 后，兩者對·OH 的清除效果增強的最為明顯。且TFP 對·OH 的清除作用明顯高于Ac-TFP對·OH 的清除作用，在多糖質量濃度為1.0 mg/mL 時，TFP 對·OH 的清除率達到 77.52%，而 Ac-TFP 對·OH的清除率為60.11%。一般來說，化學基團的引入可能會增強多糖的活性，或使多糖產生新的活性，但同時也可能使某些活性降低或者消失。與TFP 相比，Ac-TFP 對·OH 的清除作用有所減弱，可能與乙酰基引入的位置等有關，抑制了多糖的生物活性的發揮，從而降低了對·OH 的清除作用。

2.4.2 Ac-TFP 對DPPH 自由基的清除作用

TFP 和Ac-TFP 對DPPH 自由基的清除作用見圖9。

圖9 TFP 和Ac-TFP 對DPPH 的清除作用Fig.9 Scavenging capacity of TFP and Ac-TFP on DPPH free radicals

從圖9 可以看出，在一定的多糖質量濃度范圍內，TFP 和Ac-TFP 對DPPH 自由基的清除效果都隨著多糖質量濃度的升高而增強，與TFP 相比，Ac-TFP 對DPPH 自由基的清除作用增強，這可能是因為乙酰化修飾使得銀耳多糖分子間的構象發生了改變，乙酰基的引入增加了多糖分子的溶解性，更易于發揮生物活性作用，使其對DPPH 自由基的清除效果得到了相應的增強。王之珺等[18]研究了乙酰化青錢柳多糖對DPPH自由基的清除能力，發現乙酰化修飾后的青錢柳多糖對DPPH 自由基的清除能力明顯增強。

2.4.3 Ac-TFP 對 O2-·的清除作用

TFP 和 Ac-TFP 對 O2-·的清除作用見圖10。

圖10 TFP 和 Ac-TFP 對 O2-·的清除作用Fig.10 Scavenging capacity of TFP and Ac-TFP on superoxide anion free radicals

從圖10 可以看出，在一定質量濃度范圍內，TFP和Ac-TFP 對O2-·自由基均有一定的清除作用，且隨著多糖質量濃度的升高而增強，且增強的幅度在逐漸增大，但Ac-TFP 的清除作用弱于TFP，表明對TFP 進行乙酰化修飾后會減弱其對O2-·自由基的清除能力。

3 結論

該文以TFP 為原料，使用乙酸酐法對TFP 進行乙酰化修飾，以取代度為指標，利用響應面優化分析確定了TFP 乙酰化修飾的最佳工藝條件為：反應時間2.37 h，反應溫度為61.04 ℃，乙酸酐用量為2.89 mL，在此工藝條件下，乙酰基取代度為0.39。抗氧化活性結果表明，TFP 和 Ac-TFP 對·OH、DPPH 自由基和 O2-·均有一定的清除能力，且清除能力隨多糖質量濃度的升高而增大。與TFP 相比，Ac-TFP 對DPPH 自由基的清除能力有所增強，而對·OH 和O2-·清除能力減弱。