水提醇沉法提取薏米多糖及其對羥自由基的清除作用

閆旭宇，李玲

（延安大學生命科學學院，陜西延安716000）

薏米，又叫薏苡仁，為禾本科植物薏苡（Coix lacryma-jobi L.）的種仁。薏苡是一種營養豐富的糧藥兼用的一年生或多年生植物，其種仁薏米具有較全面的營養成分和特殊的藥用保健功效。薏米多糖的單糖組分較復雜，包括葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖[1]，是藥理活性較高的物質，具有降血脂、降血糖、調節免疫和防治腫瘤[2]等功效。同時，薏米多糖具有良好的耐熱性能，在100 ℃左右具有較好的穩定性[3]；并具有一定的抗氧化性，對超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（·OH）以及DPPH 自由基具有清除能力[1]。對薏米多糖提取工藝的已有研究有水提法、超聲或微波輔助提取法[4]、以及亞臨界水萃取法[5]等。超聲波作為一種輔助提取方法，通過增大溶劑分子的運動速度和穿透力，加快細胞破碎的速度，使溶劑快速的滲透到細胞中，提高有效成分的提取率和純度[6]。基于此，本研究利用超聲輔助水提醇沉法從薏米中提取多糖，通過對羥自由基的清除能力明確其抗氧化功效，為薏米多糖的進一步開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

薏米：市售。

1.1.2 試劑

石油醚、95 %乙醇、無水乙醇、無水乙醚、5 %苯酚、濃硫酸、硫酸亞鐵、30%雙氧水、水楊酸（分析純）：天津市福晨化學試劑廠。

1.1.3 儀器

AUV120 電子分析天平：上海玉博生物科技有限公司；WG-71 鼓風干燥機粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；HH-W600 數顯三用恒溫水箱：金壇市億通電子有限公司；KQ3200E 超聲波清洗器：昆山舒美超聲儀器有限公司；R-201 真空旋轉蒸發器：鄭州長城科工貿有限公司；UV2800 紫外可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；TG16G 高速離心機：湖南省凱達科學儀器有限公司；GDYQ-701S 樣品提取儀：長春小天鵝儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 薏米多糖提取工藝流程

篩選薏米→粉碎→脫脂→超聲水浴浸提→過濾→旋轉蒸發→濾液醇沉→離心→洗滌→干燥→粗多糖→溶解→待測液→測吸光度

關鍵步驟如下：

1）薏米脫脂：準確稱取20 g 薏米粉，置于索氏提取器，加石油醚回流（60 ℃）脫脂 2 次，每次 2 h 得到脫脂產物，于3 ℃貯藏備用。

2）超聲水浴浸提：取一定量的脫脂薏米粉，加入蒸餾水，攪拌均勻，超聲提取50 min 后，在電熱恒溫水浴鍋中加熱提取多糖。

3）濾液醇沉：將上清液濃縮至原來的三分之一，再加入3 倍體積的95%乙醇溶液，靜置30 min 后離心（轉速為6 500 r/min，時間為20 min），去上清液，得沉淀物，此沉淀物就是粗多糖。

4）洗滌：依次用無水乙醇、乙醚洗滌2 次，以便破壞水解殘留的脂溶性雜質。

1.2.2 測定多糖含量

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

1）標準曲線繪制：精密稱取干燥葡萄糖0.151 g，加蒸餾水溶解，定容至100 mL 容量瓶中，充分搖勻，得到質量濃度為100 mg/mL 的葡萄糖標準溶液。吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的葡萄糖標準溶液分別置于100 mL 容量瓶中，定容、搖勻。分別吸取各溶液2 mL于試管中，分別加入5%苯酚1.0 mL、濃硫酸5.0 mL，用2.0 mL 蒸餾水做空白對照和調零，靜置10 min，于60 ℃恒溫水浴10 min 取出，迅速冷卻至室溫20 ℃。在波長為490nm 下測定吸光度，繪制標準曲線并進行回歸處理，得到回歸方程為Y=0.011 9x+0.010 3，R2=0.993 2。在0～80 μg/mL 范圍內，吸光度和葡萄糖標準液的濃度呈良好的線性關系。

2）待測液中多糖的測定：精確吸取待測液2 mL 于10 mL 的容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻、靜置。從中吸取2.0 mL 液體至試管中，加入5%苯酚1.0 mL、濃硫酸5.0mL，搖勻。室溫20 ℃靜置10min 后放置60℃恒溫水浴10min 取出，迅速冷卻至室溫20 ℃。在波長為490nm 下測得吸光度值，根據標準曲線回歸方程計算出多糖濃度，求出多糖得率。多糖得率的計算公式如下：

式中：C 為薏米多糖濃度，mg/mL；V 為稀釋總體積，mL；M 為薏米粉的質量，g。

1.2.3 單因素試驗

1）料液比的選擇：固定水提取液pH 值為5.0，水浴加熱溫度為70℃，提取3 h，料液比分別設置為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），平行試驗 3 次，研究料液比對薏米多糖得率的影響。

2）提取溫度的選擇：固定水提取液pH 值為5.0，體積60 mL，水浴加熱溫度分別設置為65、70、75、80、85 ℃，提取3 h，平行試驗3 次，研究提取溫度對薏米多糖得率的影響。

3）pH 值的選擇：固定水提取液體積60 mL，水浴加熱溫度為 70 ℃，pH 值分別設置為 3.5、4、4.5、5、5.5，提取3 h，平行試驗3 次，研究pH 值對薏米多糖得率的影響。

4）提取時間的選擇：固定水提取液pH 值為5.0，體積60 mL，水浴加熱溫度為70 ℃，提取時間分別設置為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，平行試驗 3 次，研究提取時間對薏米多糖得率的影響。

1.2.4 正交優化試驗

在單因素試驗的基礎上，以提取溫度、提取時間、料液比及pH 值為試驗因素，根據單因素試驗結果，進行四因素三水平試驗確定水提醇沉法提取薏米多糖的最佳工藝參數。

1.2.5 羥基自由基清除試驗

薏米多糖及維生素C 對羥基自由基的清除率，采用水楊酸法進行測定。對羥基自由基的清除率按下式計算：

式中：E 為羥基自由基的清除率；A0為空白對照液的吸光值；Am為加入多糖后的吸光值；An為不加H2O2時多糖的吸光值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比的確定

在其他因素條件不變情況下，不同水平的料液比對薏米多糖得率的影響如圖1 所示。

圖1 料液比對薏米多糖得率的影響Fig.1 Effect of the solid-liquid ratio on polysaccharide extraction rate in adlay

由圖1 可知，隨著液體量的增加，薏米多糖得率逐漸提高，當料液比為1∶25（g/mL）時，薏米多糖得率達到最高，之后下降。這可能是由于一定比例的料液比已經使溶出的多糖量達到平衡，繼續增大料液比，可能使其他物質溶出，多糖的相對得率就降低了。另外，料液比過大會增加溶劑的用量，本著節約成本的原則，料液比為 1∶25（g/mL）左右為宜。

2.1.2 提取溫度的確定

在其他因素條件不變情況下，不同水平的提取溫度對薏米多糖得率的影響如圖2 所示。

圖2 溫度對薏米多糖得率的影響Fig.2 Effect of the extraction temperature on polysaccharide extraction rate in adlay

由圖2 可知，隨著提取溫度升高，薏米多糖得率不斷增加，在75 ℃時，薏米多糖得率最高，之后緩慢下降。這可能是由于溫度升高，分子運動速度加快，多糖更容易浸出，但是過高的溫度易導致多糖結構被破壞，進而造成多糖含量降低。因此，提取溫度應控制在75 ℃左右為宜。

2.1.3 pH 值的確定

在其他因素條件不變情況下，不同水平的pH 值對薏米多糖得率的影響如圖3 所示。

圖3 pH 值對薏米多糖得率的影響Fig.3 Effect of the pH value on polysaccharide extraction rate in adlay

由圖3 可知，薏米的多糖得率隨著pH 值的升高而增大，pH 值為4 時多糖得率達到最大，繼續升高pH值多糖得率開始降低，但在pH 值為4.5 和5 時降低幅度不明顯。這可能是由于pH 值為4～5 時，有利于多糖最大程度的溶出，繼續升高pH 值會影響多糖的結構穩定性。因此，pH 值應控制在4～5 之間。

2.1.4 提取時間的確定

在其他因素條件不變情況下，不同水平的提取時間對薏米多糖得率的影響如圖4 所示。

圖4 時間對薏米多糖得率的影響Fig.4 Effect of the extraction time on polysaccharide extraction rate in adlay

如圖4 所示，隨著提取時間增加，薏米多糖得率不斷增加，在提取時間為1.5 h 時，薏米多糖得率最高，之后逐漸下降。這可能是由于提取時間過短，多糖還沒有充分溶出，時間過長又使其他物質的溶出，影響多糖的浸出影響，或多糖提取物中的結構分被破壞。因此，提取時間選擇1.5 h 左右為宜。

2.2 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，以料液比、提取溫度、pH值、提取時間為考察因素，以多糖得率為考察指標，進行L9（34）正交試驗，因素水平見表1，正交試驗結果見表2。

由表2 的極差值大小可知，影響薏米多糖得率的主次因素依次為料液比（A）＞pH 值（C）＞提取時間（D）＞提取溫度（B），料液比對多糖得率的影響相對較大。超聲輔助水提醇沉法提取薏米多糖的最佳組合為A2B2C3D3，即料液比為 1∶20（g/mL），提取溫度 75 ℃，pH值為5.0，提取時間為2 h。在此條件下進行驗證試驗，最終得到薏米多糖得率為1.56%。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

表2 正交試驗結果Table 2 The results of the orthogonal test for optimal conditions

2.3 薏米多糖對羥基自由基的清除作用

植物多糖對羥基自由基有一定清除作用。薏米多糖羥基自由基的清除作用對如圖5 所示。

圖5 薏米多糖對羥基自由基的清除率Fig.5 The hydroxy radical scavenging rate of the polysaccharide extracted from adlay

由圖5 可知，在一定范圍內，薏米多糖提取物和維生素C 對羥基自由基清除率均逐漸增強，說明多糖提取物和維生素C 對羥基自由基的清除能力存在著一定的量效關系。在相同質量濃度下，薏米多糖提取物對羥基自由基具有一定的清除作用，但效果弱于維生素C。

3 討論與結論

多糖廣泛存在于植物體內，具有較高的藥理活性。水提醇沉法目前在植物活性多糖提取中應用最多，利用該法提取黃精多糖肽得率為0.34%[7]，提取山苦茶[8]、苦瓜[9]、蘆竹[10]及向日葵莖芯[11]等多糖得率分別為1.012%、3.12%、4.80%和6.56%。可見，不同的植物利用水提醇沉法提取多糖得率差別較大。利用超聲波輔助提取，多糖的浸提過程和活性不發生改變，浸提時間縮短，可以提高提取效率。本試驗在超聲輔助水提醇沉法的最優條件下，即提取時間為2 h，提取溫度為 75 ℃，pH 值為 5，料液比為 1∶20（g/mL）時，薏米多糖得率為1.56%，高于刑真等[12]利用熱水浸提法提取薏米多糖的提取率1.25%以及利用超聲波輔助提取薏米多糖的提取率1.41%。綜合考慮時間和能耗因素，超聲波輔助水提醇沉法適宜于在省時節能的情況下提取薏米多糖。

羥基自由基能破壞細胞膜、殺死機體紅細胞、誘導基因突變、誘發多種疾病，進而引起生命發生系統性的紊亂。研制價格低廉經濟有效的抗氧化劑是對抗羥基自由基的有效途徑。研究表明，羊肚菌[13]、別克參[14]、玫瑰茄[15]等的多糖均具有一定的抗氧化能力。本試驗中，在相同質量濃度下，薏米多糖提取物對羥基自由基具有一定的清除作用，但效果弱于維生素C。因此，加強薏米活性成分研究，擴大薏米資源的開發利用，有助于進一步推動薏米產業化發展。