酸性礦業廢水對土壤剖面中氮代謝功能基因豐度的影響

李慧 查建軍 孫慶業

（安徽大學資源與環境工程學院，合肥 230601）

作為生物生長所需的大量元素之一，氮在土壤中的含量、賦存形態直接影響著作物的產量和品質，而土壤中氮的含量、賦存形態又與土壤微生物密切相關，土壤是微生物的大本營。土壤微生物不僅種類多、數量大，且功能多樣［1]，通過參與土壤中的氮代謝過程共同驅動土壤氮元素生物地球化學循環［2]。

早期關于土壤中氮轉化微生物的研究主要基于分離、培養等手段［3]，這種研究方法不僅費時費力，且難以深入了解土壤中參與氮代謝過程不同步驟微生物的豐度及機制。現代分子生物學技術為深入了解微生物參與土壤中氮代謝過程提供了有效手段，基于分子生物學技術目前已對與氮代謝有關的土壤微生物中的固氮基因（nifH）［4-6]、氨氧化基因（amoA-AOA、amoA-AOB）［7-10]、反硝化基因（nirS、nirK和nosZ）［11-13]、厭氧氨氧化基因（HZO）［14-15]等進行了深入的研究。研究發現土壤中氮轉化功能基因的多樣性及豐度可以作為指示土壤中氮元素循環有效指標，揭示土壤中氮素的循環過程［16]。

土壤中參與氮轉化功能基因豐度的影響因素多種多樣，如偏酸性土壤中氨氧化微生物以amoAAOA為主［17]；低pH的酸性環境有利于nirS基因表達，而抑制nirK基因的表達［18]；較高濃度的有效氮抑制固氮基因nifH的表達［5，19]；影響HZO基因豐度的環境因素也多種多樣［20]，水稻土溶氧量不足時，鐵錳氧化物促進厭氧氨氧化基因表達［21]；重金屬促進或抑制性影響土壤中氮轉化功能基因表達［22-23]；剖面深度不同功能基因豐度不同等［24]。

目前，國內外關于土壤氮轉化功能基因的研究多集中于農田表層土壤或沉積物中的某一類功能基因［4-15]，而對極端環境下氮轉化多種類型功能基因及其相互關系的研究開展較少［25-26]。土壤中的氮循環是涉及多類功能基因的一個連續過程，僅僅了解其中的某一類功能基因難以深入了解土壤中氮循環過程及其影響因素。

酸性礦業廢水（Acid mine drainage，AMD）具有低pH、高鹽、高重金屬含量的特點［27]，大量的酸性礦業廢水進入農田后不僅導致土壤質量下降、糧食減產，也對土壤微生物以及土壤中的氮元素生物地球化學循環造成影響［28]。本研究以安徽省銅陵市某處受AMD污染的農田作為研究對象，基于分子生物學技術，測定受AMD污染的土壤剖面中微生物量及參與氮轉化的功能基因豐度，探討AMD污染與土壤剖面氮代謝功能基因的關系，旨為深入了解酸性礦業廢水污染農田土壤中的氮循環特點提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究區概況 研究區位于安徽省銅陵市某礦區附近受來自該礦酸性礦業廢水污染的稻田（N 30°58'26″，E 118°4'35″）， 該 地 土 壤 長 期 受 硫 鐵礦排放的AMD污染，對照稻田（N 30°58'38″，E 118°4'15″）則一直使用正常水源灌溉。該地區為亞熱帶氣候，無霜期有237-258 d，年平均氣溫16.2℃，平均濕度在75%-81%之間，年均降雨量1 346 mm，雨季集中于 7-9 月［27]。

1.1.2 樣品采集 供試稻田包括2塊，一塊受硫鐵礦排放的AMD污染、另一塊未受AMD污染（對照）。2017年4月在每塊稻田各設置5個采樣點，呈梅花狀分布，每個采樣點利用PVC管（內徑5 cm）分別采集0-10 cm、10-20 cm、20-40 cm、40-60 cm、60-80 cm和80-100 cm土壤剖面樣本。野外采集的土壤樣本經充分混勻后裝入滅菌的密封袋，然后置于4℃冰盒保存。返回室內后，除部分新鮮樣用于氨氮、硝氮含量測定和分子生物學試驗外，其余樣品于室內風干，研磨過篩后用于土壤pH、總氮、有機質和重金屬含量分析。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化分析方法 pH值用pH計測定（土壤∶去離子水=1 g∶5 mL），總氮（TN）利用總有機碳分析儀（島津TOC-L）測定；氨氮（NH4+-N）、硝態氮（NO3

--N）分別采用苯酚-次氯酸鈉比色法、紫外分光光度法進行測定；硫采用X-射線衍射光譜分析法測定；有機質采用燒失量法測定；土壤重金屬含量采用鹽酸-氫氟酸消解后，用原子吸收分光光度計（耶拿 ContrAA?700）測定。

1.2.2 總DNA提取及功能基因豐度測定 微生物總DNA提取采用CTAB法提取［27]，DNA 樣品用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后置于零下20℃冷凍保存。參與氮轉化的功能基因用上下引物在PCR儀里擴增后得到標準品，引物序列見（表1）。經擴增后純化并嵌入到pEASY-T3克隆載體（全式金，中國北京）中，并將連接產物轉染到Trans1-T1 phage-resistant chemically competent cell（全式金，中國北京）。從陽性克隆中抽提出的質粒被用來作為標準品并進行熒光PCR（qPCR）定量，測定土壤剖面中功能基因的豐度。

qPCR定量反應在ABI step-one system擴增儀上根據KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix試劑的說明書進行。qPCR熒光定量反應體系總體積為20.0 μL ：10 μL TaKaRa SYBRFAST qPCR Kit Master Mix（TaKaRa Biosystems，USA）；上下游引物（10 μmol/L） 各 0.5 μL， 樣 品 DNA 模 板 2 μL，7 μL ddH2O。以不同濃度梯度標準品作為模板進行熒光定量PCR擴增來繪制標準曲線，在熒光PCR定量儀器里進行采集熒光反應。產物的特異性用溶解性曲線以及凝膠電泳確定。qPCR的擴增效率是80%-90%，標準曲線的R2＞0.99。

1.2.3 數據分析方法 SPSS 20.0軟件用于平均值、標準誤、單因素方差分析、多因子方差分析（MANOVA）和雙變量相關分析（Pearson）等的計算，顯著性水平P＜0.05、P＜0.01作為顯著性、極顯著性判斷標準；Origin 8.0軟件用于趨勢線的繪制。

2 結果

2.1 土壤理化性質

根據相關的儀器和方法測定受AMD污染土壤的理化性質，結果如下：土壤pH為4.7-5.9，整體呈酸性，而未污染區土壤酸堿性整體呈中性；總氮含量為287.27-943.78 mg/kg，高于未污染區11.41%；氨氮含量為1.78-13.77 mg/kg，低于未污染區6.35%；硝氮1.84-5.73 mg/kg，高于未污染區55.45%；有機質含量為5.10%-5.78%，與未污染區的土壤有機質含量相似；S的含量為147.4-653.2 mg/kg，高于未污染區93.02%；Fe2O3為3.58%-5.75%，高于未污染區20.27%。土壤中的總氮、氨氮、硝氮、有機質含量有隨剖面深度而降低的趨勢，而Fe2O3隨剖面深度的增加而富集。

2.2 土壤中細菌和古菌的數量

表1 研究所用引物及序列表

本研究中，每克干土的細菌和古菌16S 豐度分別為 3.01×1013-5.80×1013copies 和 4.30×1011-9.06×1011copies，表明所研究土壤剖面中細菌數量高于古菌（圖1）。污染和對照的土壤剖面中，0-20 cm表層土壤細菌的數量均顯著高于其他各層（P＜0.0），剖面0-80 cm范圍內細菌的數量基本上呈現出隨著剖面深度的增加而降低的趨勢。不同于細菌，盡管污染和對照土壤剖面中古菌數量也隨著剖面深度增加而降低，但整個剖面中古菌生物量的降低速率則相對較慢。與未受AMD污染的土壤剖面相比，受AMD污染的0-80 cm土壤剖面深度中細菌的生物量顯著降低，而古菌僅在20-60 cm的剖面中數量顯著降低（圖1）。

圖1 AMD污染和對照土壤剖面中的細菌和古菌

表2 土壤剖面中參與N轉化的功能基因豐度（copies/g，平均值±標準誤，n=5）

2.3 土壤中氮代謝功能基因豐度

從表2可以看出，污染和對照稻田土壤剖面中不同功能基因的豐度隨剖面深度變化呈不同的趨勢。在AMD污染的土壤剖面中，0-10 cm范圍內的nifH、nosZ和HZO的豐度顯著高于其下的其他各層（P＜0.05）， 而amoA-AOA、amoA-AOB、nirS、nirK等功能基因的相對豐度盡管相差一個數量級，但統計檢驗表明并未呈現出顯著差異；對照稻田土壤剖面中，表層0-10（20）cm范圍內所測定的7個功能基因的豐度均顯著高于其下的其他各層（P＜0.05）。

對比AMD污染土壤和對照土壤剖面同一層次的相同功能基因的豐度可以看出，AMD污染土壤10-80 cm剖面中nifH基因豐度顯著小于對照區，0-40 cm剖面中的amoA-AOB的豐度也低于對照區；而剖面中nirS（10-100 cm）和HZO（40-100 cm）則表現為相反的變化。上述結果表明，AMD對土壤剖面中功能基因nifH、nirS、amoA-AOB和HZO的影響較為顯著。

AMD污染稻田土壤剖面中，參與氨氧化的功能基因（amoA-AOA、amoA-AOB）則表現為amoAAOA的相對豐度高于amoA-AOB，而參與反硝化的功能基因（nirS、nirK）總體上表現為nirK相對豐度高于nirS。這表明amoA-AOA和nirK在AMD污染稻田土壤剖面的氨氧化和反硝化作用中扮演著更為重要的角色。

3 討論

3.1 影響剖面中細菌和古菌數量的主要因素

利用16S rDNA基因豐度作為指標表征土壤中細菌和古菌數量目前已得到廣泛應用［29-30]。本研究發現無論是否受到AMD污染，土壤剖面中細菌和古菌的數量均隨著剖面深度的增加而降低，且同一層次中細菌的數量高于古菌；AMD污染剖面中細菌和古菌的數量均顯著低于未受污染的對照土壤，上述結果在其他研究中也得到證實［24，27]。研究表明，土壤剖面中微生物數量隨著深度增加而逐漸降低主要與養分（如有機質、總氮、氨氮和硝氮等）及溶解氧含量逐漸降低有關［24，30]，本研究中土壤總氮和硝氮含量與剖面中細菌、古菌的豐度均呈極顯著的正相關（r總氮-細菌=0.615，P≤ 0.01；r總氮-古菌=0.525，P≤ 0.01；r硝氮-細菌=0.367，P≤ 0.01；r硝氮-古菌=0.425，P≤ 0.01），而土壤的細菌數量高于古菌的原因可能是由于細菌相對于古菌具有更多的代謝種類和營養類型，能夠適應更多、更復雜的生態環境［31]。AMD污染的土壤剖面中細菌和古菌數量低于對照剖面則主要由于較高的重金屬含量所導致［22]，相關分析表明剖面中細菌和古菌豐度與土壤中鐵的含量呈極顯著負相關（r鐵-細菌=-0.456，P≤ 0.01；r鐵-古菌=-0.390，P≤ 0.01），說明隨酸性礦業廢水而來的鐵進入土壤導致了其中細菌和古菌數量降低。盡管剖面深度和重金屬含量均能導致土壤中細菌和古菌數量降低，但相對古菌而言（P=0.248）剖面深度對細菌數量的影響更為顯著（P=0.000）（表 3）。

表3 影響N轉化功能基因豐度因素的多因子方差分析

3.2 影響剖面中氮轉化功能基因豐度的主要環境因子

土壤中功能基因的豐度不僅受土壤微生物群落的種類組成和生物量影響［24]，還受到諸多環境因子的影響。相關分析表明，剖面中細菌豐度與nifH、amoA-AOA、amoA-AOB和nosZ呈極顯著正相關（相關系數分別為0.492、0.366、0.457和0.779），古菌豐度與amoA-AOA、amoA-AOB、nosZ和HZO也呈顯著或極顯著正相關（相關系數分別為0.569、0.270、0.673和0.476），多因素方差分析也表明（表3）剖面深度主要影響nifH、amoA-AOA、amoA-AOB和nosZ的豐度，深度對幾種功能基因豐度的影響主要與細菌和/或古菌的豐度變化有關。

本研究所分析的7個功能基因中，受AMD污染的農田土壤剖面中nifH、nirS、amoA-AOB和HZO的豐度存在顯著差異；多因素方差分析也發現，AMD污染對nifH、nirS、nirK、amoA-AOB和HZO產生極顯著影響（P＜ 0.01，表3）。本研究中，導致農田土壤污染的酸性礦業廢水來自于一處廢棄的硫鐵礦，低pH、高的硫酸根和鐵含量是該酸性礦業廢水的主要特點。雙變量相關分析進一步發現，pH與nifH和amoA-AOB呈極顯著的正相關，而與nirS、amoA-AOA以及HZO呈極顯著負相關；總硫的含量則與nosZ、amoA-AOA以及HZO呈極顯著的正相關，而鐵則表現出極顯著的負相關（表4）。

表4 剖面土中N轉化功能基因與理化性質的相關性

amoA-AOB及amoA-AOA是驅動土壤中好氧氨氧化的功能基因。本研究中，受AMD污染稻田土壤中不僅具有較高的amoA-AOA豐度，同時氨氧化古菌的數量也顯著高于氨氧化細菌（表2），表明受AMD污染的稻田中好氧氨氧化過程主要與氨氧化古菌有關，這一結果在其他的研究中也有發現［17，24]。研究表明，在中性和石灰性土壤中，氨氧化微生物在數量上以amoA-AOB為主導，在酸性土壤中以amoA-AOA 為主導［17，32]，這也就解釋了本研究中pH對amoA-AOB及amoA-AOA相對豐度有著截然不同的影響。鐵和硫與amoA-AOA的相關性也是截然相反的（表4），鐵與amoA-AOA之間的負相關性可能與鐵與古菌之間的顯著性負相關，AMD污染土壤剖面中鐵的增加導致古菌豐度降低（r鐵-古菌=-0.390，P≤0.01），伴隨著古菌數量的降低源于古菌的amoA-AOA豐度也相對降低；而硫與amoAAOA極顯著正相關，可能與硫酸鹽還原作用-氨氧化作用之間的耦合有關［33]，本研究中氨氧化功能基因amoA-AOA豐度與參與硫酸鹽還原的dsrB功能基因豐度（數據在表2中未展示）之間呈現出極顯著正相關（r=0.364，P≤0.01）。由于氨氧化古菌是AMD污染稻田中好氧氨氧化過程的主要參與者，因此本研究中總氮和硝氮含量與amoA-AOA豐度之間的正相關性是容易理解的，這種關系也被其他的研究所證實［10]。

在整個反硝化過程中，nirS和nirK是將亞硝酸鹽還原為NO的功能基因［32]，是反硝化作用的標志性反應，也是最重要的限速步驟；而功能基因nosZ則將N2O 還原為N2，是反硝化作用的最后一步。研究發現，土壤理化性質如pH、質地及含氮量等是微生物反硝化過程的重要影響因素［24，32]。本研究中，AMD對土壤剖面中功能基因nirS的影響較為顯（P＜0.05），而對nirK、nosZ等功能基因豐度的影響則相對較小或不產生影響，AMD污染土壤中nirS基因豐度顯著性大于未污染區（表2）。Samad等［18]也發現，酸性土壤環境更有利于nirS基因表達。盡管有研究發現nosZ對pH的變化十分敏感［32]，但本研究中nosZ豐度與pH之間并無顯著相關性。總氮和硝氮是反硝化過程的電子受體，已經得到廣泛證明［32]，本研究中土壤總氮和硝氮僅與nosZ具有極顯著的正相關性，而與nirS和nirK并無顯著相關性（表4），這些結果表明，總氮和硝氮對反硝化過程及其基因的影響在不同的環境條件下存在有顯著的差異性。

厭氧氨氧化（Anammox）過程是土壤中的微生物通過調控功能基因HZO將亞硝酸鹽和NH4+氧化為N2，影響該過程的環境因素包括pH、溶解氧、NO等［20]，同時剖面深度和土壤質地也對HZO功能基因豐度產生影響［34]。本研究中，pH、Fe2O3和有機質含量與HZO呈顯著或極顯著的負相關。Anammox過程是一個消耗H+的過程［15]，AMD污染條件下較酸的土壤環境可能促進了Anammox的進程；水稻土溶解氧不足時，鐵錳氧化物因充當有機質降解的氧化劑需消耗H+進行鐵氨氧化［21]，這可能是導致鐵有機質含量與HZO呈顯著或極顯著的負相關主要原因。

nifH作為固氮作用的標志性功能基因主要來自固氮細菌，這些固氮細菌多偏好酸堿度為中性的土壤環境［6]，土壤中較高的硝態氮含量對nifH產生不利影響，抑制了nifH功能基因的表達［5]，較高的有機質含量在提供固氮細菌生長需要的同時，豐富的電子傳遞系統也有利于提高nifH基因的豐度與表達［24]。

土壤剖面中功能基因豐度除了受到營養狀況和污染物含量影響外，還受到剖面深度的影響。表3可以看出，剖面深度主要影響nifH、amoA-AOA、amoA-AOB和nosZ的豐度，深度對幾種功能基因豐度的影響，一方面可能是隨著深度增加細菌和古菌的數量逐漸降低；另一方面隨著深度增加溶解氧及養分也逐漸降低，深度對功能基因豐度的影響在其他的研究中也被證實［24]。

4 結論

隨著剖面深度的增加，稻田土壤剖面中細菌和古菌數量以及參與N轉化的部分功能基因豐度逐漸降低，AMD污染導致土壤剖面中細菌和古菌的數量顯著降低，但古菌數量隨剖面深度下降的速度低于細菌；AMD對土壤剖面中功能基因nifH、nirS、amoA-AOB和HZO的影響較為顯著，在AMD污染土壤剖面中amoA-AOA和nirK在氨氧化和反硝化作用中扮演著更為重要的角色；酸性礦業廢水污染導致的pH降低及總硫和總鐵含量的增加是導致土壤剖面氨氧化和反硝化作用變化的主要原因。