一株高效降解羽毛廢棄物菌株的篩選及表達條件優化

張鈺文 袁航 于江悅 馬曉曉 史超碩 李玉

（工業發酵微生物教育部重點實驗室 天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

羽毛中90%的蛋白是由富含半胱氨酸的β-角蛋白組成的，是重要的蛋白質資源。由于β-角蛋白含有大量二硫鍵而難被降解，導致其無法直接被利用［1]。目前，羽毛廢棄物處理通常采用高溫高壓、強酸強堿和擠壓膨化等物理化學方法［2]，不僅破壞羽毛中重要的氨基酸，使某些氨基酸的消化率和利用率降低［3]，還造成嚴重的環境污染［4]。因此，利用生物酶解法可使羽毛廢棄物的處理過程更加清潔、高效。

角蛋白酶（Keratinase，E.C 3.4.21/24/99.11）是細菌［5]、放線菌［6]和真菌［7]等微生物產生的一種金屬或絲氨酸蛋白酶［8-9]，可破壞角蛋白二硫鍵使其順利分解為氨基酸及多肽，從而提高角蛋白利用率。目前角蛋白酶生產菌株產酶水平普遍偏低、發酵周期較長、生產成本較高、研究技術不夠成熟［10]等問題，致使只有少數具備商業開發價值。因此，不斷篩選和優化角蛋白酶生產菌株，降低生產成本，對實現角蛋白酶的工業化應用具有重要意義。

本研究從全國5個不同地方的豬、羊圈土壤中篩選分離了一株降解羽毛的菌株，通過菌株形態特征觀察和16S rDNA序列分析法對該菌株進行鑒定，并克隆了角蛋白酶基因序列。在此基礎上，通過篩選信號肽來提高角蛋白酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達，旨為探索信號肽與靶蛋白表達效率之間的關系研究奠定基礎，同時有助于實現重組角蛋白酶的工業化生產。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 來自新疆、河南、內蒙古、河北、山東地區的羊圈或豬圈的土壤。羽毛：來自寧夏好水川養殖有限公司。菌株與質粒：B.subtilisWB600和質粒pWB980均由本實驗室保存。試劑與培養基：DNA限制性內切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶，購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒、DNA片段純化回收試劑盒、DNA片段切膠回收試劑盒，購自OMEGA公司。

1.1.2 LB培養基 1.0%蛋白胨、0.5%酵母粉、1.0%NaCl、2.0%瓊脂粉；富集培養基：0.3%牛肉膏、1.0%蛋白胨、0.5% NaCl、pH自然；牛奶培養基：1.0%蛋白胨、1.0% NaCl、0.5%酵母粉、1.5%脫脂牛奶、2.0%瓊脂粉；羽毛粉發酵培養基：1%羽毛粉、0.05% KH2PO4、0.12% K2HPO4、0.05% NaCl、0.01%MgSO4、0.02% CaCl2、pH 7.5-8.0；發酵產酶培養基：2.0%蛋白胨、1.0%酵母粉、1.0%葡萄糖、0.3%KH2PO4、0.6% Na2HPO4、0.03% MgSO4、pH 7.5。

1.2 方法

1.2.1 產角蛋白酶菌株的篩選 稱取1 g土壤放入富集培養基中，37℃、220 r/min培養12 h。吸取5 mL上述菌懸液梯度稀釋至10-8，每個稀釋度取100 μL涂布至牛奶平板，于37℃培養箱中培養1 d。挑出產透明圈的單菌落，并進行多次傳代培養。

挑取1個傳代純化多次的單菌落，接種于50 mL LB培養基中，37℃、220 r/min培養12 h后，按照2%的接種量，接種于100 mL羽毛粉發酵培養基中，37℃、220 r/min中培養48 h，觀察羽毛降解情況并測其角蛋白酶酶活。

1.2.2 菌落和菌體形態觀察 將分離純化的菌株分別劃線于LB平板和牛奶平板中，37℃恒溫培養18-24 h，觀察菌落的形態、大小、顏色、菌落邊緣和表面質地等特征。挑取單菌落，制片，革蘭氏染色后，在光學顯微鏡下觀察菌體的個體形態。

1.2.3 角蛋白酶活力的測定 本研究參照 Yamamura等［11]的測定方法，將發酵液4℃、12 000 r/min，離心 10 min，取 250 μL 粗酶液，加入 250 μL 0.05 mol/L Gly-NaOH緩沖液（pH 10.0）溶解1%的底物（角蛋白），60℃反應10 min，加入500 μL 0.4 mol/L三氯乙酸溶液終止反應（對照組先加入三氯乙酸）。12 000 r/min，離心 5 min，取上清 500 μL， 加 入2.5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液和500 μL福林酚試劑（1∶2 V/V）混合，60℃顯色20 min。在波長680 nm下檢測吸光值。

酶活力定義：1 g固體酶粉（或者1 mL液體酶），在60℃，pH 10.0條件下，1 min水解角蛋白產生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位，以U/g（U/mL）表示。

酶活力的計算，得到測酶活的標準曲線的回歸方程：y=0.01x+0.000 7，R2=0.999 7酶活計算公式：

式中：X為樣品的酶活力，U/g（U/mL）；A為樣品平行試驗的平均吸光度；K為吸光常數；1為反應試劑的總體積（mL）；10為反應時間10 min，以1 min計；n為稀釋倍數。

1.2.4 分子生物學鑒定 采用細菌基因組DNA提取試劑盒，以菌株M的基因組DNA作為模板，用16S rDNA保守序列的通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'） 和 1 429R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'3進行PCR擴增，擴增條件為95℃預變性5 min，94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個循環，72℃再延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，純化回收PCR產物并測序。將測序結果在NCBI網站上進行BLAST比對，選取并下載相似性99%以上的序列，構建系統進化樹。

1.2.5 角蛋白酶基因的獲取 將篩選得到的高效降解羽毛菌株的16S rDNA進行測序，將測序結果在NCBI網站上進行BLAST比對，初步判定其為芽孢桿菌屬，從 GenBank 中下載芽孢桿菌中的角蛋白酶基因序列，利用軟件 DNAMAN比對后，用引物設計軟件 Snapgene在其保守區設計了一對引物，上游引物引入BamHI酶切位點，下游引物引入SphⅠ酶切位點。引物由蘇州金維智公司合成。

以試劑盒提取的菌株M基因組為模板，PCR擴增角蛋白酶基因，純化PCR產物并測序，最終確定其為角蛋白酶基因kerK。

1.2.6 表達載體的構建 利用在線工具SignalP 5.0 Serve（http ：//www. cbs.dtu.dk/services/Signa lP/） 對角蛋白酶基因kerK進行分析，可知其自身帶有Sec途徑的信號肽，以基因組為模板，設計引物KE1-F（5'-CGCGGATCCCAGGCGGCAGGGAAATCA-3'）；KE1-R：（5'-CATGCATGCTAAAAAAACCGGCGGG GC-3'），利用PCR的方法獲得不含信號肽的角蛋白酶基因kerK-1，進行純化回收。

角蛋白酶基因kerK經PCR擴增純化后，用BamHⅠ-SphⅠ雙酶切，回收，通過Solution Ⅰ連接酶連接到 pWB980 表達載體上，連接反應體系為（20 μL）：pWB980 載體片段 6 μL，角蛋白酶基因kerK片段 4 μL，Solution Ⅰ 10 μL，16℃連接 6 h，轉化入B.subtilisWB600。

將含有信號肽SPSacB、SPDacB、SPYoaW和SPNprE的質粒進行試劑盒回收。分別使用KpnI -BamHⅠ雙酶切回收信號肽片段；將信號肽片段、角蛋白酶kerK1基因通過SolutionⅠ連接酶連接到 pWB980 表達載體上，連接反應體系為（20 μL）：pWB980載體片段6 μL，信號肽-角蛋白酶基因kerK1片段4 μL，SolutionⅠ 10 μL，16℃連接 6 h，轉化入B.subtilisWB600。

2 結果

2.1 產蛋白酶菌株的初篩與復篩

從不同土壤中，利用牛奶培養基篩選得到20株能夠產蛋白酶的菌株，它們均能有效的分解牛奶培養基中的酪蛋白成分。計算得到水解圈直徑與菌株直徑的比值初步判斷菌株水解蛋白的能力。

利用羽毛粉液體發酵培養基，將初篩得到的20株有較大水解圈的菌株進行搖瓶復篩，48 h發酵后，觀察其羽毛降解情況，并以1.2.3的方法測定角蛋白酶活力。發現其中編號為M的菌株降解羽毛的效果最好，其酶活為21.98 U/mL，如圖1所示。將菌株M作為目的菌株，進行下一步的研究。

圖1 20株菌的角蛋白酶活力

2.2 形態學觀察及菌株鑒定

通過篩選獲得的菌株M，其在初篩平板上菌落為乳白色、邊緣不規則、扁平、表面光滑，挑起時較黏稠。革蘭氏染色后鏡檢，發現菌株M為革蘭氏陽性菌、短直桿狀、有芽孢，染色均勻（圖2），初步判斷其為芽孢桿菌（Bacillussp.）。

菌株M經16S rDNA通用引物進行PCR擴增，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示其大小約1 500 bp，將PCR擴增產物測序，測得分子量大小為1 463 bp。測得的16S rDNA的序列與 GenBank數據庫中的序列進行相似性比對發現，該菌株基因序列與芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等幾株芽孢桿菌屬的16S rDNA同源性均達99%以上，系統進化樹如圖3所示，初步確定該菌為芽孢桿菌。

圖2 菌株M的菌落形態和個體形態特征

圖3 菌株M的系統進化樹

2.3 角蛋白酶基因kerK及重組載體的構建

以菌株M基因組為模板，PCR擴增帶自身信號肽SPKerK的角蛋白酶基因（圖4），擴增產物測序結果與B.amyloliquefaciensK11角蛋白酶基因（GenBank：KR868996.1）相似性達到了97.63%，將其命名為角蛋白酶基因kerK，按照1.2.6所述方法，構建含有自身信號肽的重組菌株，命名該重組菌株為R1-KerK。

選取本實驗室表達堿性蛋白酶比較好的4個信號肽SPSacB、SPDacB、SPYoaW與SPNprE，分別構建重組 質 粒 pWB980-SacB-kerK1、pWB980-DacB-kerK1、pWB980-YoaW-kerK1、pWB980-NprE-kerK1，并轉化入B. subtilisWB600，獲得重組菌株分別命名為R2-SacB，R3-DacB、R4-YoaW與R5-NprE。

圖4 角蛋白酶基因PCR擴增結果

2.4 重組菌株初篩

5株重組菌株R1-KerK、R2-SacB、R3-DacB、R4-YoaW與R5-NprE在牛奶平板上，37℃，培養18 h，觀察蛋白水解圈大小，如圖5所示，與對照A相比，5株重組菌株均產生水解圈，表明5株重組菌中角蛋白酶基因均已成功表達，其中重組菌株R3-DacB的HC值（透明圈直徑與菌落直徑的比值）最大，為4.5，可以初步認為信號肽SPDacB最有利于角蛋白酶基因的表達。

2.5 發酵上清液的SDS-PAGE檢測

2.6 不同信號肽對角蛋白酶分泌的影響

5株重組菌株經48 h搖瓶發酵，取發酵液上清測定角蛋白酶酶活（圖7），信號肽SPSacB、SPDacB、SPYoaW、SPNprE和SPKerK表達角蛋白酶水平相差較大。

圖5 重組菌株的初篩

將發酵48 h的上清液進行SDS-PAGE分析，結果如圖6所示，從圖中可以看出5株重組菌上清液在相對分子質量為39 kD左右均有蛋白條帶，與角蛋白酶相對分子質量相符。說明5株重組菌株均能成功表達角蛋白酶，其中重組菌株R3-DacB的表達角蛋白酶量較高。重組菌株R1-KerK、R2-SacB、R4-YoaW、R5-NprE產角蛋白酶的酶活分別為68.15 U/mL、63.35 U/mL、18.35 U/mL和23.76 U/mL，其中重組菌株R3-DacB的酶活最高，達到了226.34 U/mL，為菌株M的10倍，是菌株R1-KerK的3.32倍。同時，利用不同菌株發酵降解羽毛，結果（圖8）顯示重組菌株R3-DacB完全降解羽毛的時間最短，相較于初始菌株M縮短了12 h。以上結果表明，信號肽對角蛋白酶的分泌表達有一定的影響，信號肽DacB能夠明顯提高角蛋白酶的表達活性。

圖6 不同重組菌株表達角蛋白酶的SDS-PAGE分析

圖7 重組菌株角蛋白酶酶活分析

3 討論

圖8 羽毛降解效果對比

羽羽毛廢棄物是家禽屠宰場中產量最高的自然角質材料。根據調查，全世界羽毛廢棄物的日積累量約為5×106萬t，是巨大的資源庫，同時大量的廢棄物堆積也造成了嚴重的環境污染問題。生物降解是最合理的處理方式，角蛋白酶是生物降解羽毛的關鍵酶，目前羽毛角蛋白降解菌的研究主要集中在細菌、真菌和放線菌。侯燕燕等［12]在新疆天然鹽堿地土壤中篩選出一 株高產角蛋白酶的耐鹽菌Bacillussp. K-18，其發酵液的角蛋白酶活力為96.7 U/mL。劉柏宏［13]篩選出一株地衣芽孢桿菌，通過對宿主菌株、調控元件及產酶條件的優化，使角蛋白酶酶活比初篩菌株酶活提高了5倍。耿秀秀等［14]從新疆戈壁沙漠中篩選出一株能夠降解羽毛的戈壁異常球菌（Deinococcus gobiensis），成功構建了表達角蛋白酶Dgker的重組菌株E.colipET22b-Dgker/BL21，其能夠在3 d內完全降解羽毛。孫蓉等［15]篩選得到一株高效降解羽毛的菌株Bacillus subtilisBS10，并且以羽毛粉為底物測定酶活力，為（1.88±0.10）U/mL。本實驗通過對篩選到的芽孢桿菌上的角蛋白酶基因在枯草芽孢桿菌中異源表達后其角蛋白酶酶活比初篩菌株提高了2.10倍。信號肽在蛋白質分泌中起到的重要作用，陳景奇［16]通過篩選比較了6種信號肽，信號肽SPNprE使α-淀粉酶AmyLM2，酶活達到260 U/mL，為其自身信號肽的1.79倍。Guan等［17]篩選了19個Sec分泌途徑的信號肽，最終獲得SPYncM，使氨基肽酶的分泌效率比原始信號肽提高了1.2倍。本實驗通過篩選比較了5種信號肽，信號肽SPDacB使角蛋白酶酶活達到226.34 U/mL，是自身信號肽SPKerK的3.32倍。研究表明，信號肽之所以能影響酶的分泌表達，可能是由于它的N區及疏水H區電荷分布的影響，還可能是由于信號肽N區稀有密碼子的缺失，從而增強酶的分泌表達［18]，H區疏水性殘基與信號肽其他區域相互作用也能夠影響酶的分泌［19]。同時很多實驗表明信號肽的篩選能夠有效地提高目的蛋白的表達量，但到目前為止，最佳的信號肽仍無法預測，只能通過大量的篩選來確定目的蛋白的最佳信號肽。在未來的研究中，可在分子層面對信號肽進行進一步改造，也可通過研究枯草芽孢桿菌分泌途徑的機制或影響分泌的其他因素，不斷提高角蛋白酶分泌表達量，以達到能夠工業化應用的目的［20]。

4 結論

本研究以羽毛為唯一碳源，從自然界中篩選到20株產角蛋白酶菌株，初篩獲得的菌株接種到含有羽毛粉的復篩培養基中進行發酵篩選，最終獲得對羽毛降解能力較強的菌株M，其酶活為21.98 U/mL。通過形態學觀察和16S rDNA序列比對，構建進化樹，經鑒定該菌株為芽孢桿菌（Bacillussp.）。克隆其角蛋白酶基因kerK，并進行信號肽的篩選比較，成功在B. subtilisWB600中構建重組菌株，發酵48 h，重組菌株R3-DacB發酵48 h時，發酵上清粗酶液中角蛋白酶活力為226.34 U/mL，是自身信號肽SPKerK的3.32倍。