內蒙古呼倫貝爾地區(qū)的可培養(yǎng)黏細菌及其抗菌活性

王雪寒 馬強 田媛 胡靖 劉惠榮

（內蒙古農業(yè)大學生命科學學院，呼和浩特 010018）

黏細菌屬于革蘭氏陰性真細菌，是一類形態(tài)特殊復雜、具有明顯的社會學特征的細菌［1]。由于黏細菌的分離純化較困難，黏細菌的研究比其他細菌少很多。但隨著分離純化方法的不斷探索與改進，菌株來源不斷增加。近年來隨著各國學者對黏細菌研究工作的深入，黏細菌的新型種屬不斷涌現，當前德國生物技術中心（GBF）共確定黏細菌菌株7 500多株，同時黏細菌保存的種屬與數量最多，山東大學及河北大學等高校更是推動了國內黏細菌分離純化的順利進行。黏細菌具有復雜的生活史和多細胞行為，可以滑行運動，能夠產生結構各異、種類多樣、活性高效的次級代謝產物，尤其是Epothilones（埃博霉素）［2-3]在抗腫瘤方面成效顯著，使黏細菌成為開發(fā)潛力巨大的一類生物類群［4-6]，更是發(fā)現和生產天然生物活性物質的“微工廠”［7]，在農業(yè)、生態(tài)、醫(yī)藥等方面具有重要的研究和應用價值［8-14]。

呼倫貝爾市地處內蒙古自治區(qū)東北部，地處東經 115°31'-126°04'、北緯 47°05'-53°20'。其地形總體特征為西高東低，地勢由西到東逐漸過渡，該地區(qū)地處溫帶北部，屬溫帶大陸性氣候，晝夜溫差和降水量差異大，降水期多集中在7-8月。呼倫貝爾市國土面積2.5×107hm2，各類資源豐富，類型多種多樣，農耕地土壤類型主要以黑土、暗棕壤、黑鈣土和草甸土為主，質地肥沃，肥力高，由于近年來人們對牧區(qū)、草原的過度開墾，導致土壤肥力逐漸下降，荒漠化現象也日趨嚴重，使其成為生態(tài)環(huán)境脆弱區(qū)［14]。

呼倫貝爾地形得天獨厚，自然資源以及土壤類型多樣，這些都預示著該地區(qū)黏細菌資源的豐富性。本研究首次對內蒙古呼倫貝爾地區(qū)的可培養(yǎng)黏細菌資源的多樣性進行研究，并對黏細菌的分布與環(huán)境因子之間的相關性及其抗菌活性進行初步分析，為今后該地區(qū)黏細菌資源的開發(fā)利用與活性物質研究的進一步探究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土樣 2016年8月從呼倫貝爾地區(qū)共采集土壤樣品20份。采集的土樣要具備均一性和代表性。根據采樣區(qū)域的大小確定取樣點數，一般面積大于3.3 hm2要取超過15個樣點，小于0.7 hm2取5-10個樣點，面積在二者之間則取10-15個點。以對角線或蛇形的方式布置采樣點，去除土壤表層雜質后，挖一個5 cm左右深度的“凹”字土坑，再混勻所有挖出的土樣，將其中的1/4收在封口袋內。依照《中國土壤分類與代碼》（GB/T 17296-2009）內土壤的分類標準，確定呼倫貝爾地區(qū)的土壤類型（表1）。測定含水量后于室溫自然陰干，過60目篩室溫保存（表 2）。

表1 土壤類型分類表

1.1.2 培養(yǎng)基 WCX固體培養(yǎng)基（pH6.0、6.5、7.2）、VY/2固體培養(yǎng)基（pH7.2）、ST21CX固體培養(yǎng)基、CAS液體培養(yǎng)基、土豆葡萄糖瓊脂（PDA）固體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨固體及液體培養(yǎng)基、酵母蛋白葡萄糖（YPD）液體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基參考Rechenbach等［15]的研究。

1.2 方法

1.2.1 土壤樣品環(huán)境參數的測定 測土壤含水量采用烘干法［16]，測 pH 值采用電位法［17]，測有機質采用重鉻酸鉀容量法（稀釋熱法）［18]，測速效鉀采用NaNO3浸提-四苯硼鈉比濁法［19]，測有效磷采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法［20]，測水解氮采用堿解擴散法［21]。

表2 土壤樣品信息

1.2.2 黏細菌的分離 土樣預處理：取約50 g土樣于滅菌培養(yǎng)皿內，加入終濃度100 mg/mL的放線菌酮溶液浸泡過夜。

在超凈工作臺內，用無菌槍頭挑取黃豆粒大小的浸泡過夜土樣接種到涂有大腸桿菌劃線的WCX培養(yǎng)基內和鋪有濾紙的ST21CX培養(yǎng)基內，另挑取粒大飽滿的滅菌兔糞3顆放入鋪有浸泡土樣的ST21CX培養(yǎng)基內，30℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，分別于2 d，10 d和7 d后開始觀察是否有子實體形成及濾紙降解情況，及時轉接到VY/2固體培養(yǎng)基和ST21CX固體培養(yǎng)基上。

1.2.3 黏細菌的純化及保存 采用子實體反復轉接的方法對黏細菌進行純化，直至無其他雜菌為止。挑取純化好的菌株于CAS液體培養(yǎng)基內30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，若培養(yǎng)基澄清則表明該菌株已純，用25%滅菌甘油于-80℃冰箱內保存。

1.2.4 黏細菌的鑒定 通過Nikon SMZ275體視顯微鏡和Sony數碼相機對純化的菌株進行形態(tài)結構觀察拍照，并參照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》和《原核生物學》的分類標準進行初步鑒定。再采用NaOH-CTAB法提取黏細菌的基因組DNA，并以通用引物27 F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1495 R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）進行16S rRNA基因序列擴增。擴增程序：94℃預變性 3 min，94℃變性 30 s，55℃退火 45 s，72℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。電泳檢測后將PCR產物送至北京博邁德基因技術有限公司測序，利用BLAST程序與GenBank數據庫內的已知序列進行同源性比對。

1.2.5 黏細菌抗菌活性的檢測 將大腸桿菌DH-5α（Escherichia coliDH-5α）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢桿菌（Bcicius subtilis）的菌液接入已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基內，在37℃，180 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng)16 h，第2天將3種菌的液體培養(yǎng)基進行離心，取菌體沉淀分別涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，晾干。用滅菌的藍槍頭扎取已純化的黏細菌，將黏細菌菌餅倒扣在涂有指示細菌的培養(yǎng)基上，并在培養(yǎng)基邊緣放上相同大小的VY/2培養(yǎng)基菌餅作空白對照，37℃恒溫培養(yǎng)48 h后觀察抑菌情況。將釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）接入已滅菌的YPD液體培養(yǎng)基內培養(yǎng)18 h后，均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，晾干。將其菌餅倒扣在涂有指示細菌的培養(yǎng)基上，并在培養(yǎng)基邊緣放上VY/2培養(yǎng)基菌餅作空白對照，37℃恒溫培養(yǎng)40 h后觀察抑菌情況。將核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solanikuhn）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的菌餅放入PDA培養(yǎng)基中心，馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）的菌餅放入黑麥培養(yǎng)基中心，再將黏細菌菌餅分別倒扣在距指示真菌約2 cm處，VY/2培養(yǎng)基菌餅作空白對照，18℃恒溫培養(yǎng)7 d后觀察抑菌情況。

2 結果

2.1 土樣環(huán)境參數測定

對內蒙古呼倫貝爾地區(qū)采集的20份土壤樣品進行了含水量、pH、速效鉀、有機質、有效磷和水解氮含量的測定（表3）。

表3 土壤樣品參數

將呼倫貝爾地區(qū)的20個土壤樣品的環(huán)境參數指標與養(yǎng)分含量分別與全國第二次土壤普查的各級土壤養(yǎng)分指標進行對比，可以得出該地區(qū)土壤整體呈酸性，其中55%為強酸性土壤，30%為微酸性土壤，10%為極度酸性土壤，僅5%為中性土壤；80%的土樣處于輕旱至重旱狀態(tài)，10%的土樣含水量處于適宜狀態(tài)，10%處于偏濕狀態(tài)；45%的土樣有機質含量處于低和很低水平，25%處于中等水平，30%處于高水平；90%的土樣有效磷含量處于極低的水平，只有5%的土樣處于中等水平；55%的土樣速效鉀含量處于低和很低水平，35%處于中等水平，10%處于高水平；水解氮的含量整體呈高水平，65%的土樣處于極高水平，15%處于高水平，10%處于中等水平，10%處于低和很低水平。

2.2 黏細菌的分離及鑒定

利用3種分離方法對20份土壤樣品進行黏細菌分離，共得到106株細菌，通過形態(tài)學鑒定及16S rRNA基因序列比對，得到黏細菌共41株（表4），包括黏球菌屬（Myxococcus）20株、珊瑚球菌屬（Corallococcus）13株、孢囊桿菌屬（Cystobacter）5株、原囊菌屬（Archangium）3株共4個屬；弱小珊瑚球菌（Corallococcus exiguous）13株、橙色黏球菌（Myxococcus fulvus）12株、黃色黏球菌（Myxococcus xanthus）8株、過渡原囊球菌（Archangium gephyra）3株和紫色孢囊桿菌（Cystobacter violaceus）5株共5個種（圖1）。其中，通過大腸桿菌劃線誘導法得到的分離菌株數及純化菌株數均為最高，經鑒定共獲得的4個屬5個種的黏細菌，且各種屬黏細菌菌株數也較其他方法多；濾紙誘導法分離到的菌株數略低于大腸桿菌誘導法，但該法并沒有純化出黏細菌，故其純菌率為0；兔糞誘導法雖然分離出的菌株數最少，但純化得到黏細菌11株，純菌率為57.89%，經鑒定該法共獲得2個屬3個種的黏細菌（表5）。

圖1 部分黏細菌菌落形態(tài)圖及相應的子實體圖（30×）

2.3 不同土樣利用方式黏細菌的分布

通過表1可知呼倫貝爾地區(qū)共有4種土樣利用方式，即草地（8份）、林地（6份）、耕地（4份）和未利用（2份）。不同土樣利用方式黏細菌的分布有所差異（圖2），耕地平均每個樣品中得到的分離菌株數和純化菌株數均高于其他利用方式的土樣，分別為7.25和2.75，未利用土地次之，草地第三，林地平均每個樣品中得到的分離菌株數和純化菌株數最低。

表4 菌株16S rRNA基因序列相似性比對分析

圖2 不同利用方式樣品分離純化的菌株數

表5 不同分離方法中黏細菌的分布情況

統(tǒng)計不同土壤利用方式中黏細菌種屬的分布情況（表6），4種土樣利用方式中均純化出Corallococcus exiguous、Myxococcus xanthus、Myxococcus fulvus和Cystobacter violaceus， 只 有 草地和林地土樣中純化出了Archangium gephyra。其中，耕地平均每個樣品中的Corallococcusexiguous、Myxococcus xanthus、Myxococcus fulvus較 多，Cystobacter violaceus數 量 較 少， 沒 有Archangium gephyra；未利用土地平均每個樣品中的Corallococcus exiguous數量較多，Myxococcus xanthus、Myxococcus fulvus、Cystobacter violaceus數 量 較 少，沒有Archangium gephyra；草地平均每個樣品中的Myxococcus fulvus數量最多，Corallococcus exiguous次之，后續(xù)依次為Myxococcus xanthus、Archangium gephyra，而Cystobacter violaceus數量最少；林地平均每個樣品中的Corallococcus exiguous數量最多，Myxococcus fulvus次 之，Myxococcus xanthus、Archangium gephyra和Cystobacter violaceus數量最少。

表6 不同利用方式土壤中黏細菌的分布

2.4 不同土壤類型黏細菌的分布

由表1可知呼倫貝爾地區(qū)土樣共有8個土壤類型，即灰色森林土（1份）、沼澤土（3份）、黑土（4份）、草甸土（3份）、暗棕壤土（2份）、風沙土（1份）、栗鈣土（3份）、棕色針葉林土（3份）。不同土壤類型中黏細菌的分布有所差異（圖3），黑土平均每個樣品分離菌株數最高，為6.5，后續(xù)依次為草甸土、栗鈣土、沼澤土、暗棕壤、風沙土、棕色針葉林；沼澤土和栗鈣土平均每個樣品的純化菌數最高，均為2.67，之后依次為后續(xù)草甸土、黑土、暗棕壤土、風沙土、棕色針葉林土，灰色森林土平均每個樣品中分離菌株數和純化菌株數最低。

統(tǒng)計不同土壤類型黏細菌種屬的分布情況（表7），只有黑土中5個種屬的黏細菌都有分布，灰色森林土樣中未純化出黏細菌，暗棕壤土僅純化出Corallococcus exiguous。沼澤土平均每個土樣中純化出的Myxococcus xanthus數量最多，Corallococcus exiguous和Cystobacter violaceus較 少，Myxococcus fulvus數量最少，沒有Archangium gephyra；黑土平均每個土樣中純化出的Myxococcus xanthus、Corallococcus exiguous、Archangium gephyra和Cystobacter violaceus數量相同且最多，Myxococcus fulvus最少；栗鈣土平均每個土樣中純化出的Myxococcus fulvus數量最多，Myxococcus xanthus次之，Corallococcus exiguous最少，未純化出Archangium gephyra和Cystobacter violaceus；棕色針葉林土中平均每個土樣中純化出Corallococcus exiguous最多，后續(xù)依次為Myxococcus xanthus、Archangium gephyra和Cystobacter violaceus，未純化出Myxococcus fulvus；草甸土和風沙土平均每個土樣中純化得到的Myxococcus fulvus數量最多，Corallococcus exiguous較少，且均未純化出Myxococcus xanthus、Archangium gephyra和Cystobacter violaceus。

圖3 不同土壤類型樣品分離純化的菌株數

2.5 黏細菌分布與環(huán)境因子的相關性分析

利用SPSS 19.0軟件對呼倫貝爾地區(qū)黏細菌的分布與其環(huán)境參數之間的關系進行分析（表8）?？梢钥闯鲈摰貐^(qū)分離得到的黏細菌總數和菌株總數均與含水量、pH、有機質、有效磷和水解氮含量呈正相關，均與速效鉀含量呈負相關，但土樣的各環(huán)境參數與分離得到的黏細菌總數和菌株總數并未有顯著的相關性。

表7 不同土壤類型黏細菌的分布

表8 呼倫貝爾地區(qū)黏細菌的分布與環(huán)境參數之間的相關性

2.6 黏細菌抗菌活性分析

對41株黏細菌進行抗菌活性檢測，通過測量抑菌圈的大小來確定其抗菌活性的強弱，圖4為一株Cystobacter violaceus的抗菌活性檢測結果，可以看出其對Escherichia coliDH-5α的微弱的抑菌圈及對Phytophthora infestans產生的明顯抑菌圈，對其他指示菌株無抑菌活性。

圖4 一株Cystobacter violaceus抗菌活性的檢測

通過對菌株抗菌活性的檢測發(fā)現，所有黏細菌對Phytophthora infestans均表現出不同程度的拮抗作用且對Escherichia coliDH-5α均有微弱的溶解能力，有3株黏細菌（1株Corallococcus exiguous，2株Myxococcus fulvus）表現出對Staphylococcus aureus的抑制作用，所有黏細菌對Bcicius subtilis、Saccharomyces cerevisiae、Sclerotinia sclerotiorum、Rhizoctonia solanikuhn和Fusarium oxysporum均未表現出抑制活性。

3 討論

從環(huán)境參數中可以看出呼倫貝爾地區(qū)土樣基本呈酸性，且多呈干旱狀態(tài)；有90%的土樣有效磷含量處于極低水平，水解氮含量整體處于中等以上水平，有機質和速效鉀含量整體處于中等偏低水平，說明該地區(qū)土壤養(yǎng)分含量不均衡。與內蒙古中部和西部地區(qū)土壤環(huán)境參數［22-23]相比較，這些地區(qū)的土壤含水量、有機質和速效鉀的含量均處于較低水平，但是中部和西部地區(qū)土壤多為中性偏堿性，而呼倫貝爾地區(qū)多為酸性土壤；中部和西部地區(qū)土壤整體有效磷含量較高，水解氮含量較低，而呼倫貝爾地區(qū)則完全相反。王璐等［24]發(fā)現，雖然呼倫貝爾市92.53%的耕地有效磷處于不同程度富集狀態(tài)，但其中鄂溫克族自治旗、新巴爾虎左旗、陳巴爾虎旗、牙克石市和阿榮旗5個旗市的耕地有效磷含量卻介于中等偏低水平，本研究中的耕地土樣均采自這5個區(qū)域，其中25%的耕地土樣有效磷含量處于中等水平，75%處于極低水平，與王璐等的研究結果相符，這可能是采樣地點土壤的溫度、降水等環(huán)境條件以及期間是否施用磷肥等因素造成的。

Dawid等［25]表明黏細菌在pH值為6-8的土壤環(huán)境中最豐富，但本地區(qū)土樣pH有一半以上呈強酸性，加之黏細菌純化周期較長，反復轉接過程中容易導致菌株的丟失，故最終分離得到的黏細菌種屬較少，共得到41株噬細菌類群的黏細菌，包括黏球菌屬（Myxococcus）20 株、珊瑚球菌屬（Corallococcus）13株、孢囊桿菌屬（Cystobacter）5株和原囊球菌屬（Archangium）3株，優(yōu)勢菌屬為Myxococcus。值得注意的是，內蒙古中部、西部地區(qū)和呼倫貝爾地區(qū)的優(yōu)勢菌均為Myxococcus，這也驗證了Myxococcus對環(huán)境適應性較強，在貧瘠和肥沃的土壤中均有分布［26]這一研究結果。與中部地區(qū)土樣中分離得到的黏細菌［22]相比，該地區(qū)沒有Pyxidicoccus和Melittangium這2個屬的黏細菌分布，與西部地區(qū)分離得到的黏細菌［27-29]相比，本地區(qū)缺少沒有Pyxidicoccus和Anqiococcus這2個屬的黏細菌分布。周秀文等［30]研究表明，黏細菌的豐度和有機碳含量、碳氮比、pH、溫度等的相關性較低，與年平均溫度和碳氮比相關性較高。本研究中，呼倫貝爾地區(qū)的黏細菌總數和菌株總數均與含水量、pH、有機質、有效磷和水解氮呈正相關，與速效鉀呈負相關，但卻并未表現出顯著的相關性，與周秀文等的研究結果基本一致，分析原因，可能是樣品采集地點有限或黏細菌未能全部純化出來，也可能是鹽度、重金屬等其他因素也對黏細菌的分布有影響［31-32]。

方曉梅等［33]關于黏細菌生態(tài)多樣性的研究中表明褐土和黑土營養(yǎng)豐富，黏細菌數量多，而沙土、風化巖中黏細菌極少。分析本研究結果數據可知，在土壤類型和利用方式不同的情況下，呼倫貝爾地區(qū)的黑土純化出黏細菌種類及數目最多，相較其他土壤類型表現出較豐富的多樣性，而暗棕壤土中的黏細菌最少；草地純化出黏細菌種類及數目最多，未利用土地最少。與內蒙古中部和西部地區(qū)相比，中部地區(qū)潮土和灰褐土中分離黏細菌較多，栗褐土和粗骨土分布較少，中部地區(qū)樣品在土樣利用方式上的黏細菌分布規(guī)律和本研究結果相同；而西部地區(qū)風沙土和草甸土中分離黏細菌較多，棕漠土和灰漠土較少，林地中菌株數目多且種類最豐富［22，27-29]。由于不同地區(qū)的同一土壤類型環(huán)境參數差異較大，以及這些土壤被不同植被覆蓋，可能造成了黏細菌種群和數量上分布的差異。

Phytophthora infestans是由致病疫霉菌引起，會造成馬鈴薯致病，已使全球馬鈴薯產業(yè)損失巨大［34]。如今殺菌劑的耐藥性日漸減弱，為防止致病能力造成的變異使作物喪失抗病性，科學家們發(fā)現了對植物病害防止較有潛力的一種方式，即以有益菌抑制有害菌，這更是目前抗馬鈴薯晚疫病生物農藥研制的重要途徑。Fusarium oxysporum會使豆類及茄科植物根系腐爛死亡，降低土壤的固氮能力等，其產生的一種名為鐮刀菌毒素［35-36]的物質會使人發(fā)生皮膚潰爛等疾病［37]；Rhizoctonia solanikuhn可使稻麥、蔬菜瓜果等根莖處致病；Sclerotinia sclerotiorum會使向日葵根莖葉盤腐爛，致病后使葵花籽的籽仁含油率及蛋白質含量下降，對向日葵產業(yè)的發(fā)展造成嚴重的影響［38-39]。除此之外本研究也對黏細菌抗大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等細菌進行了抗菌活性的分析。本地區(qū)分離得到的所有黏細菌菌株均對Phytophthora infestans表現出抗性，且不同種屬的黏細菌陽性檢出率均為100%，中部和西部地區(qū)對Phytophthora infestans有抗性的黏細菌分別占83% 和 78%［22，27-29]，Myxococcus的陽性檢出率最高。由此可見，呼倫貝爾地區(qū)黏細菌資源的開發(fā)對馬鈴薯晚疫病的防治及新藥研究可能更具潛力。本研究中不同土樣中分離得到的同一屬種黏細菌抗指示細菌和真菌的種類及抗性強弱均有差異，研究結果與武志華等［40]的研究結果相同，這表明黏細菌中的抗菌活性物質可能具有菌株特異性。李越中等［41]和張利平等［42]研究發(fā)現黏細菌中具有抗癌、抗腫瘤的活性物質，Li［43]、Dahm 等［44]發(fā)現黏細菌對林木病原真菌有抑制作用，這都為本地區(qū)黏細菌的藥用作用及生物防治的進一步研究提供了更多方向。

4 結論

呼倫貝爾地區(qū)的土樣總體呈酸性且多為干旱狀態(tài)，土壤養(yǎng)分含量不均衡。共分布有4個屬5個種的可培養(yǎng)黏細菌，優(yōu)勢菌屬為Myxococcus。該地區(qū)的黑土樣品中黏細菌種類和數量最多，而風沙土、暗棕壤土樣品中黏細菌豐富度較差；草地樣品中黏細菌的種類和數量最多，而未利用土地樣品中黏細菌豐富較差。黏細菌分布與土壤環(huán)境參數沒有明顯地相關性。所有黏細菌菌株均表現出對Phytophthora infestans有抗性，對其活性物質的確定及拮抗機理等問題需進一步探究。本研究對內蒙古呼倫貝爾地區(qū)黏細菌分布及其抗菌活性進行了分析，為未來該地區(qū)黏細菌資源的開發(fā)及利用奠定基礎。