基于LAMP的好氧反硝化菌篩選及其反硝化性能

李秋芬 劉啟臣 徐愛玲 張艷 宋志文

（1. 青島理工大學環境與市政工程學院，青島 266033；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所，青島 266071）

近年來，隨著氮素污染物的過量排放導致的水體富營養化日益嚴重，利用生物脫氮技術去除水體中氮素污染物已經成為最經濟有效、且無二次污染的熱點生物技術之一。生物脫氮理論認為，水體中氮素的去除主要利用微生物將有機氮經過氨化、硝化、反硝化作用還原為NO、N2O和N2，才能徹底去除水體中的氮素污染物［1]。可見反硝化過程是富營養化水體凈化整個脫氮過程最后且最關鍵的一步。研究參與反硝化過程的微生物不僅利于廢水的生物脫氮、土壤肥力的保存，而且對于臭氧氣層的保護，減少N2O氣體的排放均具有重要的意義［2]。因此篩選出具有反硝化功能的微生物至關重要。

反硝化主要途徑為硝酸鹽在周質硝酸鹽還原酶Nap或膜質硝酸鹽還原酶Nar的作用下還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在亞硝酸鹽還原酶Nir的作用下還原為NO，NO在亞硝酸鹽氧化還原酶Nor的作用下還原為N2O，N2O在氧化亞氮還原酶Nos的作用下還原為N2［3]。目前，已有報道對反硝化菌的篩選大多基于底物消除法，以硝酸氮和亞硝酸氮的減少作為反硝化細菌存在的依據［4]。但是，有些異養菌會通過同化作用吸收硝酸氮和亞硝酸氮，轉化成細胞物質，這樣即使檢測到兩種底物的減少，而不一定轉化成氣體。還有報道在此基礎上，通過氣體產生檢測或利用編碼反硝化酶的功能基因的PCR檢測作為篩選條件［2，5]。但是PCR檢測方法對反應條件要求高，如果條件不合適，會出現假陰性，而氣體檢測常用的氣相色譜法操作繁瑣、費用高［6]。2000年，日本研究人員Notomi等［7]報道的環介導等溫擴增（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的體外擴增DNA技術，即用2對（或3對）特殊引物和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下（60-65℃），完成核酸擴增的一種生化方法［8-9]。LAMP的擴增產物可以采用瓊脂糖凝膠電泳、濁度分析法、HNB指示劑法進行檢測［9]。由于其產物是大小長短不一的重復序列，因此可以觀察到大小不同的階梯條帶；又因為從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物（焦磷酸鎂）形成乳白色沉淀，可通過肉眼觀察判定擴增與否［10]，也可以通過加入 SYBR Green Ⅰ［11]、GeneFinder［11]等核酸染料進行終點直接觀察。反應能在1 h內完成，具有快速、簡易、高特異性及不依賴于昂貴檢測設備等優點［12]。如 Yano等［13]使用 LAMP對腸毒素大腸桿菌進行檢測；Zhong等［14]使用LAMP對臨床樣本中的人類乳頭狀瘤病毒進行檢測；Ferrara等［15]使用LAMP法對純培養的青霉菌進行檢測。然而通過LAMP方法同時利用反硝化酶的功能基因nirS、nirK和nosZ快速篩選反硝化菌株的研究報道尚未見到。為此，本研究通過選擇nirS基因、nirK基因和nosZ基因作為靶序列［16]設計小于500 bp特異性LAMP引物，結合PCR驗證和產氣檢測，建立了快速、簡便的產N2好氧反硝化菌篩選方法，從運行良好的海水養殖循環水系統的生物濾池中分離篩選到了5株性能良好的目標反硝化菌株，旨在為污廢水的脫氮治理提供一種高效、便捷的好氧反硝化菌株篩選方法和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 樣品于2018年10月取自位于青島市即墨區的中國科學研究院黃海水產研究所水產遺傳育種基地的南美白對蝦種蝦培育系統的生物濾池。該濾池對氨氮和亞硝酸氮的去除效果良好，使養殖系統的氨氮和亞硝酸氮維持在0.2 mg/L以下。取濾池水樣和掛膜材料分別置于100 mL血清瓶中，低溫保存，快速帶回實驗室。

1.1.2 主要試劑和儀器 試劑：TIANamp Bacteria DNA Kit 細菌基因組DNA提取試劑盒、LAMP體系試劑購自紐英倫生物技術（北京）有限公司、PCR試劑購自北京博邁德科技發展有限公司；所用國產化學藥品均為分析純，采購于國藥集團。儀器：SIGMA 3-18K高速冷凍離心機（Sigma，德國）；梯度PCR儀（Eppendorf，德國）；MF-chemiBIS 3.2化學發光型凝膠成像系統（DNR，以色列）；超微量核酸蛋白分析儀（Biodropsis Bo-1000，北京五洲東方科技發展有限公司）；testo 510數字式壓差儀（0-100 hPa，德國儀器國際貿易（上海）有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養基 富集培養基：參照孫雪梅［1]并有所改進：MgSO4·7H2O 0.1 g，NaH2PO40.2 g，K2HPO40.5 g，CaCO31 g，FeSO40.1 g，NaNO32.47 g，（NH4）2SO42 g，葡萄糖（孔徑0.22 μm濾膜過濾滅菌）1.25 g，過濾后的陳海水1 000 mL（固體培養基則加入2%瓊脂粉），pH 7.4-7.8，121℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min。

分離培養基［17]：KNO31.2 g、檸檬酸鈉 5 g，K2HPO41 g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.2 g，微量元素［18]（EDTA 2.06 g，FeSO4·7H2O 1.54 g，MnCl·4H2O 0.2 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，CuSO4·5H2O 0.02 g，Na2MnO40.1 g，CoCl·6H2O 2 mg，蒸餾水1000 mL）2 mL，蒸餾水1 000 mL（固體培養基則加入2%瓊脂粉），pH 7.4-7.8，121℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min。

產氣測試培養基［19]：檸檬酸鈉 5 g，K2HPO41 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，微量元素 2 mL，KNO31.2 g，KNO21.2 g，（NH4）2SO40.008 g，蒸餾水 1 000 mL（固體培養基則加入2%瓊脂粉），pH 7.4-7.8，121℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min。

反硝化能力測試培養基［19]：檸檬酸鈉 5 g，K2HPO41 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，微量元素2 mL，KNO31.2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.4-7.8。121℃高壓蒸汽滅菌 20 min。亞硝酸氮去除測試培養基則將KNO3分別替換為KNO2，各形態氮含量為50 mg/L，其余條件不變。

1.2.2 菌株富集與分離 將帶回實驗室的水樣恒溫振蕩30 min，在無菌條件下，將40 mL無菌海水加入盛掛膜材料的血清瓶中，恒溫振蕩1 h，然后取10 mL接入到90 mL無菌0.85%的生理鹽水中，恒溫振蕩15 min。

取10 mL振蕩液接種于液體富集培養基中，于28℃、180 r/min好氧條件下振蕩培養5 d，重復轉接3-4次后，取10 mL 富集液進行系列梯度稀釋，取適當倍數稀釋液100 μL均勻涂布于分離培養基上，放于28℃恒溫培養箱，培養48-72 h，根據菌落特征挑選不同形態的單菌落進行平板劃線分離，重復劃線分離4-5次，直至得到純的單菌落，13株候選菌株分別編號為KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、KFDX5、KFDX6、KFDX7、KWDX1、KWDX2、KWDX3、FJ3-1、FJ3-2 和 FJ6-1。

1.2.3 好氧反硝化菌株的LAMP初步篩選 基因組DNA提取，取分離到的13株菌株的保存菌種分別加入到2216E液體培養基中，28℃、150 r/min條件下過夜培養。取培養液進行DNA提取，方法按照TIANamp Bacteria DNA Kit 細菌基因組DNA提取試劑盒說明書的方法。將得到的基因組DNA片段，使用微量DNA定量儀進行DNA濃度和純度的檢測，然后將產物進行分裝，用于后續實驗。

LAMP引物設計，根據GenBank公布的nirS（序列號：BAK92488.1）基因、nirK（序列號：AP012279.1）基因和nosZ（序列號：KT877014.1）基因序列，應用引物設計軟件Primer Explorer V4（http：//primerexplorer.jp / elamp4.0.0）設計多組基因nirS、nirK和nosZ的LAMP引物，經優化后，選用引物序列見表1，然后由金唯智生物科技有限公司進行引物合成。

表1 LAMP用引物序列

LAMP反應體系，低溫條件下，先將樣品模板與引物充分混合。然后，配制擴增反應體系如下：10×等溫擴增反應緩沖液 2.5 μL、MgSO4（100 mmol/L）1.5 μL、dNTP Mix（10 mmol/L）3.5 μL、FIP/BIP Primers（25×）1 μL、F3/B3 Primers（25×）1 μL、Bst 2.0 DNA聚合酶（8 000 U/mL）1 μL、DNA Sample 1 μL、滅菌水補充至 25 μL，再將10×GeneFinderTM核酸染料4 μL點在離心管盒蓋內側用封口膜封口，放置60℃恒溫水浴鍋中反應60 min。檢測過程中以特定的反硝化標準菌株作為陽性對照，以ddH2O代替菌株作為陰性對照。

LAMP擴增產物的檢測，對擴增后的LAMP擴增產物采用添加GeneFinderTM核酸染料顯色液進行直接觀察的方式：水浴60 min后，將盒蓋上的染料輕輕彈下混勻后，用肉眼直接觀察顏色變化，呈熒光綠的為陽性，仍呈橙色的為陰性。

1.2.4 菌株的PCR二次篩選 為了防止通過LAMP篩選的含nirS基因或nirK基因和nosZ基因的反硝化菌株存在假陽性，而采用PCR進行進一步驗證和篩選。PCR引物為nirS-3F：5'-CCGCACCCGGGBCG-YGG -3'；nirS-6R：5'-CGTTGAACTTRCCGGT-3'［18]；nirK-1F ：5'- GGMATGGTKC -CSTGGCA-3'；nirK-5R ：5'- GGMATGGTKCCSTGGCA-3'［19]；nosZ-F：5'-CGYTGTTCMTCGA- CAGCCAG-3'；nosZ-1622R：5'-CGCRASGGCAASAAGGTSCG -3'［18]。反應體系（50 μL）為：Premix LA Tap 25 μL、Primers（25×）0.4 μL、模板 2 μL、ddH2O 補充至 50 μL。PCR 程序如下：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，：72℃延伸30 s；循環30次，最后72℃延伸 5 min，4℃保存。PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠成像系統觀察拍照。

1.2.5 菌株的產氣檢測 三次篩選 將二次篩選出來的反硝化菌株接種到500 mL反硝化能力測試培養基，然后將錐形瓶放進帶有氣體表盤和接有實時監測氣體數據的顯示器的密閉性testo 510數字式壓差儀氣罐中，28℃，150 r/min振蕩培養48 h。每間隔12 h觀察一次N2氣體產生情況，然后總結最后篩選結果。

1.2.6 菌株的反硝化性能測定 在含有1.0 g/L葡萄糖（過濾滅菌）的條件下、保持氮添加量為50 mg/L的水平，分別配制亞硝酸氮和硝酸氮的去除測試液，每組做3個平行。取對數生長期菌液將接種量控制在 1. 8 × 106- 1. 9 × 106CFU/mL 范圍內，置于28℃、150 r/min振蕩培養.每隔 12 h 取一次樣，測定NO2-N和NO3-N的值，每次同時測定各測試液的OD600值。

無機氮的分析方法參照《海洋監測規范》（GB17378. 4-2007）［1]，亞硝酸氮的測定采用鹽酸萘乙二胺分光光度法；硝酸氮的測定采用鋅-隔還原法。菌體生長量采用吸光度法，用可見分光光度計于 600 nm 處測量吸光度值（OD600）。

2 結果

2.1 菌株的LAMP初步篩選

利用建立的LAMP方法對分離獲得的13株反硝化候選菌株進行初步篩選。如圖1-A所示，由nirS基因作為靶基因的LAMP體系反應產物與GeneFinderTM核酸染料反應后，可以發現其中菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、FJ3-1 和 FJ3-2顏色變為熒光綠，結果為陽性；其余7株反應液顏色為橙色，結果為陰性。如圖1 -B所示，由nirK基因作為靶基因的LAMP體系反應60 min后，可以觀察有菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、KWDX1、FJ3-1和FJ3-2 等7株顏色變為熒光綠，結果為陽性；6株篩選的反硝化菌株反應液顏色為橙色，結果為陰性。如圖1-C所示，由nosZ基因作為靶基因的LAMP體系反應產物的顏色變化，其中，菌 株 KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和 FJ3-2等5株顏色變為熒光綠，結果為陽性；其余8株為橙色，結果為陰性。通過LAMP法對3種反硝化相關基因的檢測結果，可看出菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和FJ3-2同時含有nirS或nirK和nosZ基因，可初步認定為反硝化菌。

圖1 分別以nirS、nirK、nosZ基因為靶基因的LAMP產物直接觀察結果

2.2 PCR二次篩選

為了進一步驗證LAMP法篩選的菌株的準確性，以上述初步篩選出的菌株的DNA為模板，分別用PCR引物進行PCR驗證。分別由nirS基因、nirK基因、nosZ基因作為靶基因的PCR體系反應產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2所示。

由nirS基因作為靶基因的檢測結果（圖2-A）顯 示：7株 菌 株 中，KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、FJ3-1、FJ3-2等6株菌株有清晰條帶，表明該6株菌株含有nirS基因。與LAMP體系的結果一致。由nirK基因作為靶基因的檢測結果（圖2-B）顯示：7株菌株都有清晰條帶，該結果表明7株菌株都含有nirK基因。與由nirK基因作為靶基因LAMP體系的結果一致。由nosZ基因作為靶基因的檢測結果（圖2-C）顯示：7株菌株中，只有KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和FJ3-2等5株菌株有清晰條帶，表明該5株菌株含有nosZ基因。與由nosZ基因作為靶基因LAMP的結果一致。采用PCR驗證結果顯示，陽性菌與通過LAMP方法篩選的結果一致。由此證明，本研究構建的LAMP篩選體系簡單、快速、經濟有效且特異性高靈敏度強，可以用于快速篩選目標菌株。

圖2 以初篩菌株nirS、nirK、nosZ基因為靶基因的PCR產物的電泳結果

2.3 反硝化菌株的產氣檢測篩選

將初步篩選到的7株菌株接種到500 mL產氣測試培養基中，然后將錐形瓶放進帶有氣體表盤和接有實時監測氣壓數據的顯示器的密閉性testo 510數字式壓差儀氣罐中，28℃，150 r/min振蕩培養48 h。結果如表2所示，菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1、FJ3-1和FJ3-2等6株菌株有氣體產生。

綜合3步篩選，確認KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和FJ3-2為目標產N2的好氧反硝化菌株。

表2 七株菌株的產氣結果

2.4 菌株的反硝化性能測試結果

將7株菌在添加葡萄糖、以亞硝酸鉀為氮源的測試液中連續培養 72 h，如圖3-A所示，除菌株KFDX1的OD600值一直在0.5左右，其余菌株生長迅速，12 h即達到對數生長期，亞硝酸氮濃度迅速下降，如圖3-B 所示，7株菌對亞硝酸氮的去除均降到1 mg/L以下，7株菌株對亞硝酸氮的去除速率均在3.8 mg/（L·h）以上。隨著菌體的繁殖，48 h之后菌體生長緩慢，亞硝酸氮去除速率變慢，開始趨于平緩；72 h后，7株菌株均將亞硝酸氮降到0.5 mg/L以下，去除率高達99%。其中，菌株KFDX2去除最快，速率為3.91 mg/（L·h）、，72 h后達到最大去除率為99.04%；菌株KWDX1次之，去除速率為3.90 mg/（L·h）、72 h后最大去除率為99%；菌株FJ3-1去除速率最低，為2.63 mg/（L·h）、36 h后最大去除率也達到了99%。數據表明，篩選出含nosZ基因的菌株 KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和FJ3-2對亞硝酸氮的降解效果和降解速率都優于不含nosZ基因的菌株KFDX4、FJ3-1。

將 7 株菌在添加葡萄糖、以硝酸鉀為氮源的測試液中連續培養 72 h，如圖4-A、圖4-B 所示，12 h 后，KFDX3、KFDX4、FJ3-1、FJ3-2 菌體迅速生長，菌株KFDX1、KFDX2 12 h后才快速生長并迅速去除硝酸氮。菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、FJ3-2對硝酸氮的最大去除速率分別可達到 2.1633 mg/（L·h）、3.824 mg/（L·h）、3.773 7 mg/（L·h）、4.031 2 mg/（L·h）、3.595 8 mg/（L·h）。12-48 h 內，菌體生長達到平臺期，對硝酸氮的利用也趨于平緩。KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1、FJ3-2對硝酸氮的去除效果良好，去除率高達90%以上。其中菌株FJ3-2對硝酸氮12 h的降解率最大為98.02%，去除速率為3.595 8 mg/（L·h）；另外發現篩選出來的含nosZ基因的菌株KFDX2、KWDX1和FJ3-2對硝酸氮濃度的降解效果和降解速率優于不含nosZ基因的菌株FJ3-1。有趣的是菌株KFDX1、KFDX2、KWDX1和FJ3-1測試液中硝酸鹽氮濃度先上升，后下降，其原因有待進一步研究。

圖3 七株菌在亞硝酸氮環境中的菌量變化和去除效果

圖4 七株菌在硝酸氮環境中的菌量變化和去除效果

3 討論

常規的反硝化菌的篩選大多是通過設計運行能提供兼性厭氧條件的生物反應器輔助底物測定，周丹丹等［20]通過污泥馴化、測總氮和氮元素軌跡跟蹤法篩選好氧反硝化細菌；梁賢等［21]從馴化成熟的SBR反應器中篩選反硝化菌株。也有報道是通過普通的培養基和溫度條件加以PCR檢測篩選反硝化菌株；馮雅麗等［22]通過富集分離從深海沉積物中篩選出反硝化菌。熊焰等［23]從養殖水體中通過常規檢測和16S rRNA序列分析鑒定反硝化菌株。這些研究方法都需要繁瑣的實驗過程、特定嚴格的實驗環境、昂貴專業的實驗儀器，不利于實現快速、準確篩選。合適的DNA靶標序列是分子鑒定和檢測的基礎［24]，本研究在好氧富集、分離的基礎上，基于反硝化系列酶編碼基因nirS、nirK和nosZ的序列，建立了篩選好氧反硝化菌株的LAMP初篩技術和產氣檢測二篩技術。由于直接針對反硝化反應最后一步需要的氧化亞氮還原酶編碼基因—nosZ基因的序列，設計了 LAMP特異引物，可以直接篩選到產N2的反硝化菌株，避開了產溫室氣體NO2或N2O的反硝化菌株。同時該體系只需要在60℃下恒溫條件下反應1 h，而且反應結果通過添加核酸染料，用肉眼直接觀察顏色的變化再加上簡單的壓差儀可直接測出氣體的產生，不需要任何專業的精密的儀器如PCR儀、氣相色譜等昂貴的儀器［24]。因此本研究建立的LAMP反應體系可實現快速篩選，操作方便、經濟、靈敏［25]，可以更高效、更準確地篩選好氧反硝化菌株，用于工業廢水、生活污水及水產養殖高氮水的凈化，為今后反硝化菌株的研究提供了便捷的途徑，豐富了脫氮處理污廢水的理論，推動好氧反硝化細菌的分離及其反硝化性能的研究與應用［26-27]。

好氧反硝化細菌的分離及其反硝化性能的研究與應用得到了迅速發展［26-27]，了解好氧反硝化細菌的反硝化特性利于反硝化的深入研究，進而可以優化污廢水生物脫氮工藝、優化升級水產養殖產業。熊焰等［23]分離篩選的反硝化菌SZ-3在28℃、96 h對亞硝酸氮的降解率為91.78%；張崢［28]等從柳鋼焦化廢水A/O系統中篩選的好氧反硝化細菌f-3在36 h對硝酸氮去除率為92.85%，亞硝氮去除率為68.45%。而本研究從南美白對蝦種蝦培育系統的生物濾池通過LAMP方法篩選出5株好氧反硝化菌，在好氧條件下24 h對亞硝酸氮去除率就達到了99%，硝酸氮去除率為90%。最高去除速率可分別達 到 3.91 為 mg/（L·h）、4.0312 mg/（L·h）；明顯高于前述已報道的菌株。實驗表明利用LAMP方法以是否含有nosZ基因作為標準篩選出來的含nosZ基因的菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和FJ3-2對亞硝酸氮和硝酸氮的降解效果和降解速率優于不含該基因的菌株KFDX4、FJ3-1；同時，在實驗中發現，菌株KFDX4對硝酸氮的去除率很高，但未檢測到nosZ基因，也不產氣，可能是通過同化作用利用了硝酸氮，而不是反硝化反應；菌株FJ3-1中未檢測到nosZ基因，但檢測到有氣體產生，可能該菌株是產NO2或N2O的反硝化菌株。另外，菌株FJ3-1等在硝態氮環境里不利用硝態氮，反而促進硝態氮濃度的升高，其原因還需要進一步研究。

雖然環介導等溫擴增具有諸多優點，但是，由于LAMP具有極高的靈敏性，極易產生假陽性，所以在實驗的過程中必須保證無菌環境，減少空氣中氣溶膠的產生。本試驗在無菌條件下一次性完成，將GeneFinderTM核酸染料點在離心管的內蓋上，然后離心管用封口膜封好，待反應結束后不打開反應管的蓋子，將事先加在盒蓋上的染料輕輕彈下，直接觀察顏色變化，避免了氣溶膠擴散到空氣中，為后續LAMP反應試驗創造無菌環境，減少因假陽性結果出現而影響LAMP檢測結果的準確性［29-30]。

4 結論

建立的LAMP體系在60℃下反應60 min，通過GeneFinderTM核酸染料染色直接觀察法從南美白對蝦種蝦培育系統的生物濾池中快速準確地篩選出7株同時含有nirS基因或nirK基因和nosZ基因的好氧反硝化菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、KWDX1、FJ3-1和FJ3-2；再進行PCR驗證和產氣測試，最終確定5株可產N2的好氧反硝化菌KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1 和 FJ3-2。

篩選出來的含nosZ基因的菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和FJ3-2對亞硝酸氮和硝酸氮的降解效果良好，對和的去除率分別達到99%和90%以上，最大去除速率分別可高達 4.9 mg/（L·h）和 4.03 mg/（L·h）。降解速率優于不含該基因的菌株KFDX4、FJ3-1。