一株高效好氧反硝化細菌的分離鑒定及脫氮性能研究

李文甫 杜柳冰，2 劉思瑩 翁美遂 舒琥 陳瓊華

（1. 廣州大學生命科學學院，廣州 510006；2. 中山大學醫學院，廣州 510000）

高密度集約化的池塘養殖模式常會引起水質污染，特別是水體氨氮、硝態氮和亞硝態氮等嚴重超標，對水生動物有直接且嚴重的毒害作用，造成經濟巨大損失［1-5]。針對現階段養殖池塘的嚴重問題，生物脫氮是一種有效途徑［6]。傳統生物脫氮一般認為硝化作用是好氧的自養過程，反硝化作用是嚴格或兼性厭氧的異養過程［7]，使得需要單獨設置缺氧單元，增加成本和管理難度。

20世紀80年代，Robertson等［8]報道了好氧反硝化細菌和好氧反硝化酶系存在，可在有氧條件下進行硝化和反硝化過程。后來研究者們從污水處理設施、魚塘、稻田等環境中分離出好氧反硝化菌［9-10]。Srinandan等［11]從污水處理廠污泥樣品中分離出高效反硝化功能的叢毛單胞菌屬（Comamonassp.）和假單胞菌（Pseudomonassp.）；成鈺等［12]從刺參養殖環境中分離出具有異養硝化和好氧反硝化的花津灘芽孢桿菌（Bacillus hwajinpoensis）；王田野等［13]從長期施用農家肥的土壤中篩選出一株屬不動桿菌（Acinetobactersp.）的耐高氨氮脫氮菌株等［11-13]。這種新型脫氮菌株極大改良了傳統生物脫氮的不足，異養硝化-好氧反硝化細菌已成為目前生物脫氮研究熱點。但現階段研究水平所分離的脫氮菌株，仍然具有如脫氮周期長，降氮形式單一等不足之處。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品 廣東省廣州市西朗珠江水產所養殖池池水及底泥。

1.1.2 培養基 BTB 培養基［14]（g/L）：KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，Na2HPO47.9 g，檸檬酸鈉 5.66 g，NaNO30.8415 g，NH4Cl 0.192 g，NaNO20.362 g，微量元素溶液 2 mL，BTB溶液1 mL，瓊脂 25 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0-7.5；反硝化培養基（g/L）：KNO30.53 g，檸檬酸鈉3.0 g，KH2PO40.25 g，Na2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 1 g，瓊脂 20 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0；牛肉膏蛋白胨硝酸鹽培養基［15]（g/L）：牛肉膏5 g，蛋白胨 10 g，KNO31 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g，H2O 1 000 mL，pH 7.2-7.4；DM發酵培養基（g/L）：KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，Na2HPO47.9 g，檸檬酸鈉5.66 g，微量元素溶液 2 mL，NH4Cl 0.603 6 g（或 NaNO30.959 0 g 或 NaNO20.375 g），H2O 1 000 mL，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 稱取泥樣10 g和水樣10 mL分別用無菌水稀釋制備成10-1稀釋液，取0.1 mL在新鮮BTB、反硝化和牛肉膏蛋白胨硝酸鹽培養基中涂布，28℃恒溫培養2-3 d，挑取單菌落劃線3-4次，鏡檢驗純并斜面保種于4℃冰箱。

1.2.2 脫氮性能菌株的初篩 純化菌株接種于BTB反硝化鑒定培養基培養1-2 d，根據生長情況和培養基顏色圈大小情況篩選出具有反硝化能力的菌株；再將篩得菌株接種異養硝化鑒定培養基于28℃，180 r/min培養2 d，利用格里斯試劑檢測篩得具硝化能力的菌株。

1.2.3 脫氮性能菌株的復篩 將1.3.2得到的菌株取3環活化斜面接種于營養肉湯以28℃，180 r/min恒溫搖床培養1 d，測其OD600值，以1%接種量再接至以氨氮（NH4-N）、硝態氮（NO3-N）以及亞硝態氮（NO2-N）作為唯一氮源的DM發酵液中以28℃，180 r/min恒溫搖床培養，于0 h、24 h和48 h取發酵液液測其OD600值，并以5 000 r/min，5 min離心處理，測氨氮（NH4-N）、硝態氮（NO3-N）以及亞硝態氮（NO2-N）的含量。

1.2.4 硝化性能及反硝化性能測定 選擇復篩后高性能菌株BB-17作為目標菌株，取斜面3環活化斜面接種于100 mL含氨氮（NH4-N）、硝態氮（NO3-N）以及亞硝態氮（NO2-N）作為唯一氮源的種液中以28℃，180 r/min恒溫搖床中培養1 d并測其OD600值；再以1%的接種量接種于含對應種液不同氮源發酵液中以28℃，180 r/min恒溫搖床中培養2 d。于0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h 和 48 h 取樣液測其OD600值，以5 000 r/min，5 min離心處理，取其上清液測其總氮（TN）、氨氮（NH4-N）、硝態氮（NO3-N）以及亞硝態氮（NO2-N）的含量。

1.2.5 氮素檢測方法及去除率計算 氨氮（NH4-H）采用納氏試劑分光光度法（GB HJ535-2009）測定；硝態氮（NO3-N）采用紫外分光光度法（GB HJ/T346-200）測定；亞硝態氮（NO2-N）采用N-（1-萘基）-乙二胺二鹽酸鹽分光光度法（GB 7493-87）測定；總氮（TN）采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法（GB HJ636-2012）測定。去除率的計算公式如下：

式中：C0表示0 h相應氮源濃度（mg/L），Ci表示發酵培養后某時間相應氮源濃度（mg/L）。每組設置3組平行，采用Excel對實驗結果進行統計分析與繪圖。

在治療期間所有患者禁止食用難以消化、油膩性、刺激性的食物,對照組患者采用常規藥物治療,即口服嗎丁啉,10mg/次,一天三次[2]。研究組患者加強針刺穴位治療,其具體如下:取雙側四縫穴,位置在第二到第五指掌面,第一、二節橫紋中央。用五號、六號注射針頭,左手扶住手指,刺手快速點刺。點刺深淺根據年齡、體質決定,刺后用雙手擠出少許血液或淋巴液即可。取坐位,雙手伸開,常規消毒,將五號、六號注射針頭,垂直、快速的刺入穴位,快速起針,不用留針。

1.2.6 菌株形態學鑒定 接種菌株到營養瓊脂平板中28℃培養24 h，觀察單菌落的生長情況，染色鏡檢觀察菌體形態特征并拍照記錄。

1.2.7 菌株16S rDNA分子鑒定 以細菌基因組DNA為模板擴增其16S rDNA，擴增采用一對通用引物：上游引物（27F）：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物（1492R）：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'。DNA模板提取采用TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR裂解酶，取20 μL 于滅菌PCR管中，用滅菌槍頭挑取單菌落至于管中攪動后取出，80℃金屬浴15 min，低速離心取上清液作為模板。PCR反應體系（50 μL）：上海翊圣生物2×HieffTMPCR Master Mix（With Dye）25.0 μL，上游引物和下游引物各 2.5 μL，DNA 模板 5 μL，無酶水 15 μL。PCR 程序如下 ：（1）94℃預變性，5 min；（2）94℃變性，1 min ；（3）55℃退火，1 min ；（4）72℃延伸1.5 min；（5）72℃，8 min；（2）-（4）步循環 30 次。瓊脂糖凝膠電泳（1×TBE電泳緩沖液，1%瓊脂糖）分析PCR結果。PCR產物的純化和測序由上海生物工程有限公司完成，測序結果通過ExBioCloud進行比對分析，并利用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

2 結果

2.1 分離純化與初篩的菌株

經3種篩選培養基分離純化出的菌株的平板初篩，初步獲得82株生長狀態良好并具有利用培養基中氨氮、硝態氮和亞硝態氮的菌株。利用BTB反硝化鑒定培養基的顯色反應，以及格力斯試劑檢測顏色深淺情況，初步篩選具有反硝化能力的菌株共有51株，占篩選出細菌總數62.20%，而具有硝化能力的菌株共有31株，占篩選出細菌總數37.80%。其中，既具有反硝化能力又兼有硝化能力的菌株共有16株，占篩選出細菌總數19.51%。不同培養基分離純化結果如表1所示，牛肉膏蛋白胨硝酸鹽培養基共篩得17株，占總數20.73%；反硝化培養基篩得29株，占總數35.37%；BTB培養基篩得36株，占總數43.90%。其中由BTB培養基篩得泥樣的降氮能力數量最多。

表1 不同培養基分離純化的菌株

2.2 菌種降氮性能復篩結果

對2.1初篩獲得菌株，以氨氮，硝態氮和亞硝態氮為唯一氮源進行脫氮能力測定。如圖1-3所示，其中大多數菌株在氨氮為唯一氮源的培養基中生長良好，大部分在24 h達到生物最大量并在48 h下降。由圖1和圖2可見，多數菌株在氨氮和硝態氮唯一培養基中生長良好，但相對其他兩種氮源更多的菌株在單一亞硝態氮中生長較為緩慢。

圖1 不同菌株在氨氮為唯一氮原的培養基中的生長情況

不同菌株的脫氮情況見表2，篩得多數菌株能夠高效利用氨氮和亞硝態氮，其中FA1、FA2、BB1和BB17在48 h能夠對氨氮降解達到高于90%，BB1、BB17和BB3在48 h能夠對亞硝態氮降解達到高于99%，相比菌株對于氨氮和亞硝態氮的利用，大多數菌株對硝態氮的去除能力不強，更多地表現為對氨氮或亞硝態氮的攝取降解。

圖2 不同菌株在硝態氮為唯一氮原的培養基中的生長情況

圖3 不同菌株在亞硝態氮為唯一氮原的培養基中的生長情況

表2 不同菌株搖瓶48 h的OD600值及其脫氮率

2.3 高效菌株BB-17的脫氮特性研究

在2.2所得到的復篩結果中，選擇一株性能明顯且高效的異養硝化-好氧反硝化菌株BB-17，進行以NH4Cl、NaNO3和NaNO2為唯一氮源的脫氮性能測定。

2.3.1 BB-17菌株對NH4Cl的脫氮特性 以NH4Cl為唯一氮源，BB-17菌株生長狀況及其脫氮特性如圖4所示。菌株在經歷約6 h遲緩期后生長速度急劇上升進入對數期，在18 h時OD600到達生物最大量。18 h后菌量出現緩慢下降。在菌株遲滯期間，氨氮去除率趨于平緩，隨著菌株進入生長對數期，氨氮去除率隨后在6 h到18 h急劇上升，并達到最大值93.92%，此時氨氮濃度達到最低，在18 h后去除率開始緩慢下降。總氮去除率與OD600和氨氮去除率趨勢基本一致，都體現為先升高，在第18 h到最大值68.96%，再降低，30 h后總氮去除率趨于平緩。由于菌株的硝化作用，將培養液中唯一氮源NH4Cl轉化為亞硝酸鹽和硝酸鹽，菌株能夠快速利用氨氮來自身合成生長所需物質，在18 h利用率達到最高，而氨氮濃度也達到最低。在后續生長過程中，亞硝酸鹽的積累也可能影響菌株的生長，理化性質改變可能導致細菌自身大量分解，釋放菌體內自身氮源，從而使總氮含量短時間內回升，總氮去除率下降。在30 h之后，培養液中總氮去除率相對處于平緩狀態。

2.3.2 BB-17菌株對NaNO3的脫氮特性 以NaNO3為唯一氮源，BB-17菌株生長狀況及其脫氮特性如圖5所示。菌株在經歷約6 h遲緩期后，生長速度在6 h到12 h期間開始緩慢上升進入對數期，在12 h到18 h期間生長速度急劇上升并在18 h時OD600達到生物最大量。18 h后菌量緩慢下降，下降至36 h后呈現平緩。硝態氮降解率隨著菌株進入對數期而升高，在0 h到18 h與OD600趨勢大致相同，24 h后，硝態氮去除率趨于平緩，直到42 h又開始緩慢上升，在48 h達到最大去除率66.11%。總氮去除曲線與菌株生長曲線趨勢基本一致，呈現為0 h到12 h升高到達降解最大值49.32%，12 h后緩慢下降，在42 h后出現回升。在以NaNO3唯一氮源培養基進行發酵培養，因菌株的反硝化作用，培養體系中有亞硝態氮生成，菌株需要再適應并后續利用其作為氮源合成營養物質，因而生長狀態較為緩慢。

圖5 BB-17菌株在以NaNO3為唯一氮源的培養基中的生長曲線及硝態氮和總氮降解情況

2.3.3 BB-17菌株對NaNO2的脫氮特性 以NaNO2為唯一氮源，BB-17菌株生長狀況及其脫氮特性如圖6所示。菌株在經歷約18 h的遲緩期后，生長速度由18 h到24 h的緩慢上升，到24 h到36 h急速上升，并在36 h后生長速度減慢趨于穩定，在42 h 時OD600達到生物最大量。42 h后菌量開始下降。亞硝態氮去除率曲線與生長曲線趨勢大致相同，0 h到18 h趨于平緩，18 h到36 h去除率大快上升，36 h后趨于穩定，在48 h處達到最大值99.11%。總氮去除率與生長曲線趨勢大致相同，呈現從0 h到36 h先升高達到最大值74.33%。36 h后總氮降解率開始下降。菌株適應期較長有可能是因為初始亞硝態氮濃度過高，后期由于菌株的反硝化作用，利用培養液中唯一氮源NaNO2，菌株適應環境后，能夠快速利用亞硝態氮來自身合成生長所需物質。

圖6 BB-17菌株在以NaNO2為唯一氮源的培養基中的生長曲線及亞硝態氮和總氮降解情況

2.3.4 BB-17菌株形態學鑒定 如圖7所示，BB-17在營養瓊脂平板上為圓形米白色菌落，邊緣整齊不透明，表面光滑濕潤，具有黏性。

圖7 BB-17菌株平板菌落形態特征

如圖8及圖9所示，BB-17經染色鏡檢為短桿菌，無芽孢革蘭氏陰性，圖中箭頭所指即其端生鞭毛。

圖8 BB-17菌株單染色鏡檢圖

2.3.5 BB-17 16S rDNA鑒定及其同源性分析 以細菌基因組DNA為模板，27F和1492R為上下游引物擴增其16S rDNA，并以不加入菌體DNA模板的PCR產物作為陰性對照，將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖10，在1 500 bp左右處得到一條單一、明亮的條帶。將PCR 產物送至上海生工生物工程有限公司測序，所得序列經過EzBioCloud數據庫比對分析，與Pseudomonas vancouverensis（AJ011507）具有98.41%同源性，可初步確定BB-17為假單胞菌屬，并將其命名為Pseudomonassp. BB17。

圖9 BB-17菌株鞭毛染色鏡檢圖（箭頭所指即為鞭毛）

圖10 BB-17菌株16S rDNA PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

將Ezbiocloud數據庫上與BB-17 16S rDNA序列比對具有最高相似度的Pseudomonas vancouverensis、P. moorei、P. umsongensis和P. mohnii等菌株通過MEGA 7.0軟件構建系統發育樹，結果如圖11所示。BB-17菌株與P. vancouverensis（AJ011507）在進化上具有較高的同源性，但由于其16S rDNA匹配度并不高，BB-17有可能是新菌種，但仍需結合形態學和生理生化特征進行進一步鑒定。

3 討論

異養硝化-好氧反硝化菌在自然界中廣泛存在，現已在多種環境中分離純化得到。根據本實驗方法，在含氮養殖池水中分離篩選得到具有高性能異養硝化-好氧反硝化能力菌株，其中具有高效脫氮能力的細菌大多數在塘泥當中，在水中能夠脫氮的細菌的數量較少。使用3種不同氮源組成的培養基以模擬多種不同氮源環境搖瓶測定脫氮性能，得到數量可觀的高性能菌株。并以一株性能明顯的BB-17菌株作為對象，測定該菌株在3種唯一氮源的培養基中發酵的脫氮性能，BB-17其對于總氮（TN）、氨氮（NH4-N）、硝態氮（NO3-N）以及亞硝態氮（NO2-N）4個指標均有良好的脫氮性能。結合形態學和16S rDNA序列比對的方法，初步鑒定BB-17菌株屬于假單胞菌屬（Pseudomonassp.），并對該菌株命名為Pseudomonassp.BB17。

本方法從養殖池塘篩得菌株具有高效脫氮能力。篩選得到的菌株在24 h左右達到生物最大量和最大脫氮率。其中高性能菌株BB-17具有優秀的高效脫氮性能。在發酵培養中，BB-17菌株在以NH4Cl為唯一氮源的DM培養基中生長速度最快，以NaNO3為唯一氮源其次，在以NaNO2唯一氮源的則生成速度較慢。BB-17在以NH4Cl為唯一氮源的DM培養基中氨氮去除情況在18 h達到最大值93.92%，而在以NaNO3為唯一氮源的DM培養基中硝態氮去除情況在48 h達到最大值66.11%，另外在以NaNO2為唯一氮源的DM培養基中亞硝態氮去除情況在48 h達到最大值99.10%，不同之處在于生長周期不同，氨氮培養基中BB-17在18 h達到單一氮源下的生物最大量，在硝態氮培養基中與氨氮培養基基本一致，但在亞硝態氮培養基中生長緩慢，約于42 h達到生物最大量。所得結果與牟東陽等從活性淤泥中分離篩選出P.sp.DK1 情況類似，相比于沈輝等［17]從海洋分離得到的鹽單胞菌屬Halomonas和產堿桿菌屬Alcaligenesx細菌和菜鈺穎等［18]從活性污泥中所分離的生長周期約6 d的菌株，BB-17均有達到生物最大量時間短和脫氮率高等優點［16-18]。但在不同氮源中BB-17對于脫氮能力的表現并不相同。結合BB17的生長情況分析比較，原因可能是菌株對不同氮源的適應性不同，對不同氮源的利用能力也有所不同［19-21]。不同氮源培養基中總氮降解率的差距在于菌株對不同氮源適應性以及利用率的問題，也可能是菌株的硝化性能以及反硝化性周期規律性問題，同時也存在于培養體系因取樣問題而減少，導致降氮情況有所改變也不排除培養體系減少而導致生長體系中營養物質減少、代謝廢物過多的可能。綜上所述，高性能菌株BB-17在初步搖瓶發酵探究其脫氮性能中，表現出優秀的特性，主要包括菌株生長速度快、脫氮周期短、降氮類型多樣和降解能力強等優點，為后續應用于實際廢水的脫氮研究提供重要的理論指導意義。

圖11 基于16S rDNA序列同源性構建BB-17菌株的系統發育樹

4 結論

本研究從廣州市西朗珠江水產所養殖池池水及底泥中分離純化得到16株異養硝化好氧反硝化菌株，從中篩選得到1株高效脫氮的菌株BB-17。測定其在單一氮源培養基發酵的生長曲線和脫氮性能，顯示菌株BB-17在28℃培養48 h，基本在6-24 h內到達生長對數期，其氨氮去除率在18 h可達93.92%，硝態氮去除率在48 h可達66.11%，亞硝態氮去除率在48 h可高達99.10%。經過鑒定BB-17為革蘭氏陰性短桿菌，16S rDNA序列分析結果與Pseudomonas vancouverensis（AJ011507） 比 對 具 有98.41%同源性，確定BB-17為假單胞菌屬并命名為Pseudomonassp. BB17。