一株耐鹽對硝基苯酚降解菌的分離及其降解機理研究

任磊 劉斌 藺中 甄珍 劉月廉 胡漢橋 閆艷春

（1. 廣東海洋大學農學院，湛江 524088；2. 中國農業科學院研究生院，北京 100081）

硝基酚類化合物是一類重要的化工原料，是精細化工產品生產的重要中間體，被廣泛地應用于染料、農藥、醫藥、合成材料、機械和木材防腐等領域［1]。其中，單硝基酚類化合物包括鄰硝基苯酚（orthonitrophenol，ONP）、間硝基苯酚（meta-nitrophenol，MNP）和對硝基苯酚（para-nitrophenol，PNP）3類，以PNP使用范圍最廣、使用量最大［2-3]。對硝基苯酚可通過不同途徑進入環境，已成為環境中硝基酚類污染物典型代表之一。大多數硝基芳烴化合物有致癌、致畸及致突變作用，一些硝基化合物經過肝臟和腸道微生物代謝還可生成致癌物質和致癌物質的前體［4]。由于對硝基苯酚具有良好的水溶性，導致其很容易隨水體流動進行遷移而易進入地下水系統，且在深層土壤和地下水中持留較長時間［5]。同時，由于對硝基苯酚在較低濃度（＜10 μmol/L）條件下，就可解除呼吸鏈氧化磷酸化過程，從而改變細胞代謝過程，因此對人體健康及環境生物具有較大威脅［6]。對硝基苯酚已被美國環保署（US EPA）列為優先控制污染物之一，在我國也被列入水中優先控制污染物黑名單［7]。

對硝基苯酚高效降解方法的探索一直是國內外研究熱點之一，研究較多的包括吸附法、氧化法、生化法以及生物降解法［8-10]。對于生物降解而言，具有較好環境適應性的降解菌的分離為生物降解及環境修復等相關生物技術提供了重要的菌種資源，降解相關基因的克隆與功能驗證為降解工程菌的構建及固定化酶技術等提供了重要基因資源。本研究以對硝基苯酚為底物，從長期受生活廢水污染的近海灘涂分離獲得了高效對硝基苯酚降解菌RL-JY1，對菌株進行了系統的鑒定與環境適應性分析，并對菌株RL-JY1降解對硝基苯酚的代謝途徑及相關分子機制進行了探索，以期豐富硝基酚類降生物降解的微生物與基因資源，為硝基酚類化合物的生物降解提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 本研究所使用的降解菌RL-JY1為本實驗室分離獲得，目前已保存于廣東省微生物菌種保藏中心（保存編號：GDMCC 60494）；使用的感受態細胞Escherichia coliDH5αDTA克隆用載體（pMD19-T）均購自TaKaRa公司。

1.1.2 試劑 對硝基苯酚（分析純，95%）購于百靈威科技，溶于色譜純甲醇（購自Fisher公司）并調整濃度至1×105mg/L作為儲備液，待使用時根據需要添加并調整至目標濃度；酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉等配制培養基所需的主要成分均購自Oxoid公司；基因組提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、連接轉化試劑盒、質粒提取試劑盒等均購自TaKaRa公司；PCR引物合成及DNA測序均委托英濰捷基公司完成；甲醇與乙腈均為色譜純，購自Fisher公司；其余試劑與耗材均購自國內廠家。

1.1.3 培養基 無機鹽離子培養基（MSM）：（NH4）2SO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl20.01 g/L，KH2PO41.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，Na2HPO4·12H2O 1.5 g/L，NaCl 10.0 g/L，定容至指定體積后滅菌備用。

富集培養基（EM）：蛋白胨 5 g/L，酵母粉 5 g/L，KH2PO41.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，NaCl 10.0 g/L， 定容至指定體積后滅菌備用。

LB培養基（LB）：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，定容至指定體積后滅菌備用。

以上培養基均使用NaOH或HCl調整pH至7.0，添加瓊脂粉至1.5%（W/V）即得固體培養基，所有培養基均在121℃滅菌25 min后備用。

1.2 方法

1.2.1 對硝基苯酚降解菌的富集與分離 土樣和海水樣品均采自廣東省湛江市霞山區附近海域灘涂（北緯 21° 12' 29″，東經 110° 24' 55″）。取 5 g土樣或 5 mL水樣，加入100 mL新鮮的MSM培養基中，并添加對硝基苯酚至50 mg/L，培養液于30℃，180 r/min條件下培養（避光培養）。培養5 d后，取5 mL的培養液加入100 mL新鮮的MSM培養基中，添加并提高對硝基苯酚至100 mg/L，培養液于30℃，180 r/min條件下培養（避光培養）。重復此操作，每次提高對硝基苯酚濃度50 mg/L至培養液中初始對硝基苯酚濃度達到500 mg/L。

選取黃綠色消失的培養液（對硝基苯酚易溶于水，呈黃綠色），將獲得的培養液劃線培養至MSM固體培養基（含100 mg/L對硝基苯酚）上，獲得平板于30℃條件下避光培養。每12 h對平板進行一次觀測，至平板上長出較多單菌落后，挑取單菌落接種至LB液體培養基中培養24 h（30℃，180 r/min）后取 1 mL菌液離心（6 000 r/min，5 min），菌體用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）沖洗后再次離心（6 000 r/min，5 min），重復沖洗步驟3次，獲得的菌體用于降解能力測定。將獲得的菌體接種至10 mL新鮮的MSM培養基中，并添加對硝基苯酚至終濃度100 mg/L，作為處理組；以相同條件下的MSM并添加對硝基苯酚至相同濃度，但不添加菌液，作為對照組。將獲得的培養液于30℃，180 r/min條件下培養（避光培養），培養5 d后，取培養液檢測對硝基苯酚濃度。

根據測得處理組與對照組中對硝基苯酚的濃度，計算菌株對對硝基苯酚的降解率，計算公式如下：

其中，Cck指t時刻對照組中對硝基苯酚的濃度，Ct指t時刻處理組中對硝基苯酚的濃度。取降解率大于90%培養液進行再次劃線培養，重復上述過程至獲得穩定可降解的單菌為止。

1.2.2 對硝基苯酚降解菌的鑒定 基于形態學與生理生化特征分析，結合16S rRNA基因分析對獲得的對硝基苯酚降解菌進行鑒定。將獲得的降解菌劃線接種至LB固體培養基上，于30℃恒溫培養24 h后用于菌落形態觀察，并參考《常見細菌系統鑒定手冊》對菌株進行生理生化特征分析［11]。

使用細菌基因組小提試劑盒（TaKaRa）提取目標菌株的基因組并用于16S rRNA基因擴增，所使用的16S rRNA基因擴增通用引物27F和1492 R引物序列如表1所示，PCR反應條件如表2所示。使用切膠回收試劑盒對PCR產物進行回收，將回收產物連接至pMD19-T載體后轉入E. coliDH5α感受態細胞，并通過藍白斑篩選陽性克隆；對獲得的陽性克隆進行質粒提取（質粒小提試劑盒），提取后的質粒送英濰捷基進行測序；測序結果進行BLAST分析并構建系統發育樹，使用MEGA 7.0進行系統發育樹構建，采用NJ法進行發育樹的構建（Bootstrap值為1 000）［12]。

表1 基因名稱與引物序列

表2 各基因PCR反應條件

1.2.3 溫度、初始pH及鹽度對降解率的影響 為探索環境因素對降解率的影響，選擇了典型的溫度、pH及鹽度作為研究對象進行探索，具體條件設置，見表3。將獲得的降解菌在LB液體培養基中培養至OD600=0.8后取1 mL菌液進行離心收集菌體（菌體離心與洗滌辦法參考1.2.1進行）。所有對照組與處理均12 h取樣一次進行對硝基苯酚濃度測定，且所有處理組與對照組均設3次重復，并根據測得對硝基苯酚濃度計算菌株對對硝基苯酚的降解率。

表3 溫度、初始pH及鹽度對降解率影響分析的條件設置

1.2.4 菌株降解對硝基苯酚的代謝產物檢測與代謝途徑分析 將獲得的降解菌接種至含100 mg/L對硝基苯酚的MSM液體培養基（pH 7.0）中，在30℃，180 r/min條件下避光培養，每12 h取樣一次進行代謝產物提取與檢測。代謝產物的提取參考Samanta的方法［13]，具體如下：將獲得的培養液進行離心收集上清并加入等體積的乙酸乙酯充分震蕩混勻后移取有機相（中性提取），再向剩余的水相中加入鹽酸調整pH至2.0后再加入等體積的乙酸乙酯充分震蕩混勻后移取有機相（酸性提取），最終將中性提取和酸性提取的有機相混合。通過氮吹儀將混合后的有機相吹干，將獲得的沉淀用1 mL的甲醇復溶后用0.22 μm的有機相濾膜過后用于代謝產物的質譜分析。采用LC-MS進行代謝產物的質譜檢測，具體條件如下：島津LC-MS（8040），流動相為甲醇（100%），流速0.2 mL/min，采用直接進樣（進樣量1μL），在負離子模式下檢測，毛細管電壓為3.5 kV，載氣為氮氣（99.9%），掃描范圍為100-600 m/z，使用Realtime Analysis對數據進行采集和分析。

1.2.5 對硝基苯酚降解相關基因的克隆 根據已報道的對硝基苯酚降解相關基因設計引物，引物名稱與序列信息見表1，以獲得的降解菌基因組為模板進PCR擴增，PCR反應條件見表2。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對獲得的條帶進行切膠回收，連接至pMD19-T載體并轉入E. coliDH5α感受態細胞，并通過藍白斑篩選陽性克隆；對獲得的陽性克隆進行質粒提取（質粒小提試劑盒，TaKaRa），提取后的質粒送英濰捷基進行測序；測序結果進行BLAST分析并與已有報道的對硝基苯酚降解目的基因進行比對與分析。

1.2.6 對硝基苯酚檢測方法的建立 基于高效液相色譜法（HPLC）對樣品中硝基苯酚的濃度進行測定。首先，建立對硝基苯酚的HPLC的檢測方法，具體如下：高效液相色譜儀為安捷倫1260（Agilent，USA），色譜柱為Eclipse Plus C18（4.6×75 mm，3.5 μm），流動相為甲醇、乙腈和水的混合物（80∶10∶10），流速3 mL/min，柱溫30℃，進樣量20 μL，檢測器為可變波長檢測器（VWD），檢測波長為320 nm。通過配制標準濃度的對硝基苯酚溶液，并建立與320 nm處吸收值關系的標準曲線（R2均大于0.99）。對硝基苯酚的HPLC檢測結果與標準曲線如圖1所示。所有樣品均需經孔徑為0.2 μm的濾膜過濾后，再經HPLC檢測。

2 結果

2.1 對硝基苯酚降解菌的分離與鑒定

經多次富集與篩選，分離獲得一株可高效降解對硝基苯酚的菌株，命名為RL-JY1，該菌株可以對硝基苯酚為唯一碳源，在72 h內對100 mg/L對硝基苯酚的降解率為100%。該菌在LB平板上呈乳白色，圓形，表面光滑濕潤，菌落邊緣光滑（圖2），菌株的生理生化特征如表4所示。

經PCR擴增、連接、轉化及測序后，獲得了一段長度為1 495 bp的16S rRNA基因的部分序列，序列信息已遞交至GenBank（登錄號為：MK101056），通過 BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）與已報道的序列進行比對，初步判斷菌株RL-JY1為假單胞菌屬（Pseudomonassp.）細菌。根據BLAST的初步比對結果，從LPSN（List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature，http：//www.bacterio.net/index.html）數據庫下載相關菌屬細菌16S rRNA基因序列，用于系統發育樹的構建，16S rRNA基因序列分析結果（圖3）顯示菌株RL-JY1與惡臭假單胞菌（P.putida）親緣關系較近。根據16S rRNA基因序列分析結合生理生化特征分析，確定菌株RLJY1為惡臭假單胞菌。

圖1 對硝基苯酚的HPLC檢測結果與標準曲線

圖2 菌株RL-JY1在LB平板上的菌落形態

表4 菌株RL-JY1的生理生化特征

2.2 溫度、初始pH及鹽度對菌株RL-JY1降解對硝基苯酚的影響

溫度對菌株RL-JY1降解對硝基苯酚的影響如圖4-A所示，可以看出菌株RL-JY1具有較寬的溫度耐受范圍，在20-40℃間，對100 mg/L對硝基苯酚的72 h降解率均大于95%（20℃時為96.3%，30℃與40℃均為100%）；當溫度為10℃或50℃時菌株對對硝基苯酚的降解受到顯著抑制（47.3%，10℃；68.5%，50℃）。不同初始pH對菌株RL-JY1降解對硝基苯酚的影響如圖4-B所示，菌株RL-JY1在pH 5-7范圍內，隨著pH值的升高，菌株對對硝基苯酚的降解率（72 h，100 mg/L）逐漸升高，當pH為7.0時，72 h內對100 mg/L對硝基苯酚降解率為100%；當pH值超過7.0以后，隨著pH值的上升菌株對對硝基苯酚的降解率逐漸下降，當pH值為10.0時，72 h對100 mg/L對硝基苯酚的降解率為52.7%；值得注意的是，在pH 5.0、6.0、8.0和9.0條件下，菌株72 h對對硝基苯酚（100 mg/L）的降解率均大于60%（pH為5.0時降解率為46.2%，pH為6.0時降解率為63.7%，pH為8.0時降解率為96.2%，pH為9.0時降解率為72.3%），由此可判斷菌株RL-JY1對pH有較寬的耐受范圍，并對酸性條件具有較好的耐受能力。鹽度對菌株RL-JY1降解對硝基苯酚的影響如圖4-C所示，在NaCl濃度為0-8%范圍內，對硝基苯酚的降解率無明顯變化，當NaCl濃度超過8%后，隨著NaCl濃度升高，降解率逐漸下降（NaCl濃度達為10%時，降解率為71.4%；NaCl濃度達為12%時，降解率為43.6%）。

圖3 菌株RL-JY1的16S rRNA基因系統發育分析

2.3 菌株RL-JY1降解對硝基苯酚的代謝產物及代謝途徑分析

通過對不同培養時間點的樣品進行質譜分析，獲得了菌株RL-JY1降解對硝基苯酚的代謝產物信息（圖5-A）；結合已有對硝基苯酚降解相關報道，推測質譜檢測獲得的對硝基苯酚降解產物包括4-硝基兒茶酚（m/z=153.8000）、偏苯三酚（m/z=125.1000）和馬來酰乙酸（m/z=157.1000），進一步提出菌株RL-JY1降解對硝基苯酚的代謝途徑如圖5-B所示，即典型的偏苯三酚途徑。

圖4 環境因素對菌株RL-JY1降解對硝基苯酚的影響

圖5 菌株RL-JY1降解對硝基苯酚代謝中間產物檢測與代謝途徑分析

2.4 對硝基苯酚降解相關基因的克隆

以提取的菌株RL-JY1基因組為模板，通過設計的引物進行PCR擴增并對PCR產物進行電泳檢測，結果如圖6所示。其中，pnpABC基因的PCR產物電泳檢測結果為陽性，且條帶大小與目標片段大小一致。對目標條帶進行切膠回收、連接、轉化并送測序。對測序片段進行BLAST比對分析，并與已有報道的pnpABC基因序列進行比對，結果顯示，來自于菌株RL-JY1中的pnpA、pnpB和pnpC基因與惡臭假單胞菌DLL-E4的pnpA、pnpB和pnpC基因的序列一致性分別為99%、98%和100%，翻譯后的氨基酸序列相似性均為100%。同時，基于獲得的菌株RL-JY1對對硝基苯酚的代謝途徑，結合已有報道，確定了獲得的參與對硝基苯酚降解的相關基因的特定功能（圖5-B）。

圖6 對硝基苯酚降解相關基因pnpABC的電泳檢測

3 討論

對硝基苯酚作為硝基酚類化合物中的典型代表，伴隨其大量使用，其在環境中被廣泛檢出，同時，其對人體健康及環境安全的影響也得到了廣泛和深入的研究。探尋高效、安全且經濟的環境污染治理方法，是廣大科研工作者孜孜以求的目標。針對對硝基苯酚的生物降解，目前已有較多的降解菌被分離報道，代謝途徑（主要包括通過偏苯三酚和鄰苯二酚介導的開環代謝途徑）及相關分子機制（典型的如pnp基因簇與npd基因簇）也已得到了一定程度的研究［14-17]。但需要指出的是，具有良好環境適應性、惡劣條件耐受能力菌株的降解菌報道仍然較少。因此，分離獲得具有良好環境適應性的降解菌，為環境修復及工業廢水處理提供新的降解菌資源具有重要意義。同時，對于菌株降解對硝基苯酚代謝途徑與相關分子機制的闡明，為菌株的改造與工程化應用提供了理論參考。

本研究從長期受城市廢水污染的近海灘涂的海水與淤泥樣品中，經過多次富集、馴化，分離獲得一株可高效降解對硝基苯酚的細菌RL-JY1，經菌落形態、生理生化特征及16S rRNA基因分析，確定該菌為惡臭假單胞菌。目前，已報道的可降解對硝基苯酚的細菌種屬包括紅球菌屬（Rhodococcussp.）［18]、勞爾氏菌屬（Ralstoniasp.）［19]、無色桿菌屬（Achromobactersp.）［20]、節桿菌屬（Arthrobactersp.）［21]、假單胞菌屬［22]、莫拉克斯氏菌屬（Moraxellasp.）［23]、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）［24]等，其中節桿菌屬和假單胞菌屬分別是革蘭氏陽性與革蘭氏陰性細菌的典型代表。

在環境適應性方面，菌株RL-JY1對環境溫度與pH具有良好的耐受能力，對溫度與pH都具有較寬的耐受范圍。在相對較高溫度（50℃）時，菌株RL-JY1對對硝基苯酚仍具有較強降解能力（68.5%），這可能是由于菌株RL-JY1分離自常年氣溫較高的雷州半島（中國大陸最南端），長期的環境馴化使得菌株對于環境溫度表現出較好的耐受能力；菌株對于環境pH較寬的耐受范圍對于菌株RL-JY1在環境污染修復及工業廢水處理中的應用具有重要意義；同時，菌株RL-JY1表現出對鹽度良好的適應性，在一定程度是由于樣品采自沿海灘涂（沿海灘涂由于水分的蒸發，而鹽分留在土壤中，鹽度在不同時間略有變化）。目前，不論是環境污染修復還是工業廢水處理，都面臨著相同的問題，即環境因素復雜且處理條件惡劣，如環境溫度變化較大、工業廢水處理條件復雜（污染物濃度較高、高鹽及極端pH）等。環境適應性分析的結果表明，菌株RL-JY1具有良好的環境適應能力與應用前景。

已有關于對硝基苯酚降解途徑與相關分子機制的報道中，對節桿菌屬與假單胞菌屬的研究較為深入，也分別是革蘭氏陽性與革蘭氏陰性細菌的典型代表，且代謝途徑與相關基因也可以革蘭氏陽性與革蘭氏陰性細菌為區分歸類討論。已報道的對硝基苯酚的降解途徑主要有兩類：（1）通過對苯二醌將對硝基苯酚轉化為對苯二酚并進一步被開環利用，因此也被稱作對苯二酚代謝途徑（Hydroquinone，HQ），這種代謝途徑在革蘭氏陰性細菌中報道較多［25]；（2）通過4-硝基兒茶酚將對硝基苯酚轉化為偏苯三酚并進一步開環利用，因此也稱作偏苯三酚代謝途徑（1，2，4-Benzenetriol，BT），這種代謝途徑在革蘭氏陽性細菌與陰性細菌中均有報道［16，26]。而對應的參與對硝基苯酚降解的相關基因也非常保守，革蘭氏陽性細菌中以節桿菌為代表，由雙組分的氧化還原酶將對硝基苯酚轉化為偏苯三酚，偏苯三酚再由偏苯三酚雙加氧酶開環生成馬來酰乙酸，相關基因簇已經得到較深入的研究；同時，值得注意的是已報道的節桿菌屬細菌除了可以降解對硝基苯酚，還可降解其他對位取代酚，如對氯苯酚和對氟苯酚［27-28]。而在革蘭氏陰性細菌中，以假單胞菌屬為代表，可以同時通過偏苯三酚和對苯二酚對對硝基苯酚進行降解，其中的氧化還原酶可將對硝基苯酚轉化為偏苯三酚或對苯二酚，對苯二酚的降解主要是通過對苯二酚雙加氧酶進行開環，而偏苯三酚則通過偏苯三酚雙加氧酶開環，同樣，相應的基因/基因簇在革蘭氏陰性細菌中的也較為保守。本研究中獲得的降解菌RL-JY1為具有代表性的惡臭假單胞菌，通過質譜分析與基因克隆手段明確了其遺傳背景與代謝途徑相，為具有良好環境適應性與高效降解潛能工程菌的構建提供了重要的理論支撐。

4 結論

從長期受城市廢水污染的近海灘涂分離獲得了一株對硝基苯酚降解菌RL-JY1，通過生理生化特征分析與16S rRNA基因分析，確定該菌株為惡臭假單胞菌。菌株RL-JY1對于環境溫度、pH及鹽離子濃度都具有良好的適應性。基于代謝產物分析確定菌株RL-JY1通過偏苯三酚途徑對對硝基苯酚進行降解。同時，基于對已有報道的對硝基苯酚降解相關基因設計引物，克隆獲得了參與對硝基苯酚降解上游途徑的相關基因。本研究從菌株特性、代謝途徑及相關分子機制3個水平系統闡明了菌株RL-JY1對對硝基苯酚的降解機理，結果表明菌株對對硝基苯酚具有高效的降解能力、良好的環境適應性和較好的應用潛能。