一株木質素降解菌的鑒定及其降解特性

胡笑峰 張朵朵 周云橫 衛亞紅 陳少林

（西北農林科技大學生命科學學院 旱區生物質能研究中心，楊凌 712100）

木質素是地球上數量最多的芳香族聚合物［1]，與纖維素、半纖維素共同組成木質纖維素。木質纖維素是目前生物質能源可研究和利用的主要材料。作為一種可再生能源，生物質的開發利用是解決目前人類能源危機的重要途徑之一，但是天然纖維質原料的木質化很大程度上限制了其可利用性［2]。在地球碳循環中，木質素降解處于中心地位，因為大多數碳或者存在于木質素中，或者存在于受木質素保護免受酶降解的纖維素和半纖維素中［3]，所以木質素能否順利降解也極大地影響著纖維素的有效利用。此外，木質素作為一種造紙工業的副產物，由于很難被降解，排放到環境中后會導致嚴重的水生態污染［4]。相較于傳統的物理轉化和化學轉化，開發低能耗、清潔度高和對環境友好的生物法降解木質素正成為研究者關注的焦點。白腐真菌是木質素降解中最主要的微生物，對其木質素降解，產酶條件的優化等方面的研究是目前生物技術應用的熱點［5-6]。然而，細菌具有來源廣、生長快、便于工程改造且易于工業化生產等優勢，因此，細菌降解木質素的研究也具有廣闊的前景。本研究利用選擇培養基初步篩選具有木質素降解功能的細菌，通過16S rRNA基因序列分析鑒定菌株，進一步明確了菌株QL-Z3具有以堿木質素為唯一碳源進行生長代謝的木質素潛在降解性能。并對其相關酶學展開研究，為具有實際應用價值的木質素生物降解技術的開發提供途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 供試土壤采樣地位于秦嶺西部的辛家山林區（海拔：1 500-2 000 m；經緯度：106°E，34°N），土樣采集點的植物群落為華山松，采樣深度為0-10 cm。

1.1.2 培養基 （1）菌種活化培養基：LB培養基（蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH為7.0-7.2）。（2）液體木質素培養基：堿木質素 3 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCl20.08 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，MnCl20.02 g/L，KH2PO41 g/L，蛋白胨2 g/L，固體培養基添加瓊脂粉15 g/L。自然pH。（3）基礎培養基（BM培養基）：酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，pH為7.0左右。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選鑒別［7]稱取5.0 g土壤樣品于100 mL液體木質素培養液中，30℃、180 r/min振蕩培養48 h。將各培養液從10-1稀釋至10-6，吸取0.1 mL涂布于木質素培養基平板，30℃恒溫培養。待平板上長出單菌落后，再次于木質素培養基平板劃線純化。挑取純化后的單菌落經液體擴大培養后按1∶1的體積比加入50%甘油，混勻后保存于-80℃冰箱。取-80℃保藏的菌株經過LB培養至對數期后，使用Bacterial DNA Kit（Omega）提取總DNA，以總DNA為模板，使用27F/1492R通用引物進行16S rRNA基因PCR擴增。根據電泳條帶有無，挑選其中陽性克隆菌落，送西安擎科生物工程公司測序。將序列上傳到NCBI數據庫中比對BLAST，用MEGA6.0軟件繪制系統發育樹，判斷菌株所屬類別［8]。

1.2.2 菌株的生長測定 將QL-Z3菌株接種于LB培養基中，30℃、180 r/min培養至OD600為1.2左右，5 000 r/min離心菌體5 min，用生理鹽水洗滌2次后懸浮，取菌液按1%的接種量接種于液體木質素培養基中，30℃、180 r/min連續培養。通過培養液離心前后在600 nm處的吸光度差值來反應菌株的生長狀況：

第n小時的OD600=OD600a-OD600b

OD600a：培養液在600 nm吸光度直接測定值；OD600b：培養液經5 000 r/min離心5 min后上清液在600 nm吸光度測定值。

1.2.3 木質素降解率的測定 280 nm處的吸光度作為木質素濃度測定指標［9]：

第n小時木質素降解率（%）=（A0-An）/A0×100 A0：接菌前培養基中木質素的濃度；An：接菌培養n小時后培養基中木質素的濃度。

1.2.4 木質素降解酶的定性檢測［10-11]采用苯胺蘭（Azure-B）和RB亮藍（Remazol brilliant blue）染料平板檢測，在BM培養基中分別加入0.1 g/L的染料苯胺蘭和RB亮藍，鋪平板后接種菌株，在30℃恒溫培養箱中靜置培養，每天觀察，以平板培養基中菌落周圍脫色圈的有無來定性檢測木質素降解酶是否產生。

1.2.5 木質素酶活力的定量測定方法 （1）木質素過氧化物酶的測定［12]：反應體系為3 mL，反應混合液含有1.85 mL 0.24 mmol/L藜蘆醇和1.0 mL粗酶液，預熱至37℃后加入，0.1 mL 6.0 mmol/L的H2O2啟動反應，并測定3 min前后在310 nm下吸光度值的增加量。一個酶活力單位（U）定義為每分鐘使1 μmol藜蘆醇氧化所需要的酶量。（2）漆酶的測定［13]：在25℃ 3 mL反應體系中，反應混合液含有2 mL 0.5 mmol/L的ABTS（溶于0.1 mmol/L，pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中），加入1 mL粗酶液啟動反應，每隔1 min 測定420 nm下的吸光值，取吸光值線性變化部分，一個酶活力單位（U）定義為每分鐘氧化1 μmol ABTS所需要的酶量。（3）錳過氧化物酶的測定［13]：在37℃ 3 mL反應體系，反應混合液含有2.4 mL 50 mmol/L pH 4.5的醋酸緩沖液，0.1 mL 1.6 mmol/L MnSO4溶液，0.4 mL粗酶液，37℃下加入0.1 mL 1.6 mmol/L的H2O2溶液啟動反應，測定最初3 min內在240 nm下吸光度值并取線性變化部分。一個酶活力單位（U）定義為每分鐘使1 μmol Mn2+轉化為Mn3+所需的酶量（以上定量測定試驗均做3次重復）。

1.2.6 粗酶液的制備［14]液體木質素培養基中30℃搖瓶培養的菌液8 000 r/min離心10 min所得的上清液即為粗酶液。

1.2.7 掃描電鏡（SEM）觀察［15]分別取30℃、180 r/min培養3 d和7 d的未接菌（空白對照）和QL-Z3接種量為1%的木質素培養液50 mL，12 000 r/min離心10 min，上清液經液氮速凍后放入真空冷凍干燥儀中干燥至恒重，干燥后的樣品噴金后進行電鏡掃描觀察。

2 結果

2.1 菌株QL-Z3的菌種鑒定

將菌株QL-Z3的16S rRNA基因序列與NCBI中現有數據庫進行序列比對分析，選取結果中相似度最高的屬作為對應菌株分類標準，并繪制系統進化樹。由圖1可知，菌株QL-Z3的16S rRNA基因序列與登錄號為AM055711的歐文氏菌屬菌株Erwinia billingiaeEb661相似度最高，為99%，因此鑒定菌株QL-Z3為歐文氏菌，命名為Erwiniasp. QL-Z3。該菌株GenBank登錄號MH828331；在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株保藏編號為CGMCC 1.16623。

2.2 菌株QL-Z3的生長及木質素的降解

由圖2可以看出，菌株Erwiniasp.QL-Z3能在以木質素為唯一碳源的培養基中生長，在發酵48 h后，菌株的生長量達到最大，OD600達到0.31。此外，結果顯示在經過72 h培養后，培養液在280 nm處的吸光度由初始1.90降為1.63。這意味著在經過72 h的發酵，14.23%的木質素被菌株QL-Z3降解。

圖2 菌株生長曲線和木質素降解曲線

2.3 菌株QL-Z3酶活的定性及定量檢測

2.3.1 定性檢測 木質素的降解主要是依賴一系列酶的共同作用［16]，這些酶主要包括木質素過氧化物酶（Lignin peroxidases，LiP）、錳過氧化物酶（Manganese peroxidases，MnP）和漆酶（Laccase，Lac）。苯胺藍的脫色與LiP及MnP的產生有關，但不反映漆酶的產生，漆酶能使RB亮藍脫色。結果如圖3所示。菌株Erwinia sp. QL-Z3對苯胺藍有較強的脫色能力，對RB亮藍有一定的脫色作用。根據平板的脫色結果，表明在無木質素誘導物存在的情況下菌株Erwinia sp. QL-Z3具有產木質素降解酶的能力，但據苯胺藍和RB亮藍平板脫色反應只能簡單判斷菌株的產酶情況，要具體確定菌株的木質素降解能力，需進行木質素降解酶活的定量測定試驗。

圖3 菌株Erwinia sp.QL-Z3脫色情況

2.3.2 定量測定 圖4為該菌株分泌3種胞外酶的能力，從圖4中可以看出，QL-Z3具有較強的錳過氧化物酶分泌能力，在前2 d酶活增加較快，且在60 h達到最大值263.83 U/L，隨后降低。然而分泌木質素過氧化物酶和漆酶的能力相對較弱，漆酶在培養48 h后達到了最高酶活，僅有77 U/L，木質素過氧化物酶也在第48小時達到最大值104.11 U/L，隨后緩慢降低。這3種酶的合成均是在菌株生長對數期和穩定期內，且酶活變化趨勢與菌株QL-Z3在木質素培養基中的生長規律基本一致。

圖4 木質素降解過程中QL-Z3 酶活曲線

2.4 掃描電鏡（SEM）分析

利用掃描電鏡觀察木質素降解過程中的形貌變化，是目前證明木質素能否被微生物修飾或降解的重要技術手段之一［17]，將木質素樣品在Erwinia sp.QL-Z3降解前后的形態放大相同的倍數后，可以看出未經細菌處理的木質素樣品（圖5-A）結構致密且呈塊狀，而經Erwinia sp. QL-Z3處理3 d后的樣品（圖5-B）結構呈疏松多孔狀，經Erwinia sp. QL-Z3處理7 d后的樣品（圖5-D）結構疏松多孔更為明顯。通過對比圖5-A、5-B、5-C、5-D可證明菌株Erwinia sp. QL-Z3能夠對木質素樣品進行解聚，破壞木質素結構，使其裂解成細小的碎片。

3 討論

由于木質素的結構復雜，作為世界上第二豐富的可再生有機資源卻一直未被充分利用。研究者們對木質素綜合利用方法的探索已進行了幾十年，然而仍存在許多問題，如化學法易造成二次污染，物理法能耗過高，而生物法雖對環境友好，但也存在效率低的問題。目前普遍存在的燃燒或者廢棄木質素的做法會極大地浪費能源并污染環境，因此篩選高效降解木質素的微生物具有現實意義，這不僅充分利用了廢棄物，而且對開發以木質纖維素為原料的生物質能源也具有重要意義。

圖5 木質素樣品掃描電鏡圖

目前，國內外研究歐文氏菌主要集中在病原菌的研究，著重關注其致病性的較多。如Hirakawa等［18]研究了Erwiniacarotovora在植物液泡細胞死亡過程中的作用；Antonio等［19]研究了植物對Erwinia amylovora致病性產生適應性的原因。近幾十年來，木質素的微生物降解研究主要集中于白腐真菌和褐腐真菌等真菌的研究上［20]，同時，也有越來越多的研究者從森林土壤或造紙廢水中篩選鑒定出能降解木質素的細菌，如Streptomyces griseorubensAG-11［21]、Sphingomonas paucimobilisSYK-6［22]、Bacillusspp.［23]、Klebsiellasp. BRL6-2［24]、Rhodococcus jostiiRHA1［25]，這些研究表明，細菌在生物多樣性和環境適應性等方面比真菌更具優勢。木質素降解機制十分復雜，在降解途徑上，許多研究者基于試驗結果提出了相關的推測，如Shi等［26]在細菌菌株Cupriavidus basilensisB-8中推測出β-Ketoadipate代謝途徑、苯酚降解途徑和龍膽酸代謝途徑。此外，研究者還發現苯甲酸代謝途徑是木質素降解過程中的主要代謝途徑，主要存在于細菌中［27]?？傊?，盡管對于細菌降解木質素機制已經有了大量的推測性研究［28-29]，但由于細菌的種類不同，其代謝途徑也不完全相同，且此類研究不夠系統，尚未完整系統地描述細菌中木質素的降解途徑和代謝機制。因此，建立模式細菌，利用成熟的組學技術和先進分析手段，構建細菌降解木質素的完整代謝途徑是急需解決的問題。本實驗的研究對象Erwiniasp. QL-Z3是一株從土壤中分離到的細菌，試驗結果表明該菌株能將木質素作為唯一碳源進行生長，并且能分泌Lip、Mnp和Lac等3種重要的木質素降解酶，具備對木質素進行解聚，破壞木質素結構的能力。這表明該菌株在將來生物質能源利用及木質素污染的環境治理方面有著潛在的應用價值。國內外鮮有關于歐文氏菌降解木質素的相關文獻報道，分離得到菌株Erwiniasp. QL-Z3并證明其木質素降解性能，可豐富木質素降解的細菌種類并為尋找降解利用木質素的微生物提供備選菌株，從而為開發利用以木質纖維素為主要來源的生物質能源提供更多選擇。

4 結論

本研究從森林土壤樣品中分離得到一株具備木質素降解潛力的菌株QL-Z3，經鑒定屬于歐文氏菌屬（GenBank登錄號MH828331；中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號CGMCC 1.16623）。該菌株能夠利用堿木質素為唯一碳源生長，定性和定量檢測均表明該菌株具備分泌木質素降解酶的能力，并且通過對木質素的解聚可使木質素形貌發生改變。在以堿木質素為唯一碳源的液體堿木質素培養基中發酵48 h，菌體生長達到穩定期，OD600達到0.31，發酵72 h，木質素降解率為14.23%。木質素降解相關酶活力在發酵48 h和60 h達到峰值：發酵60 h Mnp達到263.83 U/L，發酵48 h Lip和Lac分別達到104.11 U/L和77 U/L。本研究較為系統地揭示了Erwinia屬菌株的木質素降解性能，該菌株可作為木質素降解的優良備選菌株。