堆肥過程中纖維素降解菌的分離與鑒定

李林超 張超 董慶 郭成 周波，2 高崢

（1. 山東農業大學作物生物學國家重點實驗室 . 山東農業大學生命科學學院，泰安 271000；2. 土肥資源高效利用國家工程實驗室，泰安 271000）

農業固體廢棄物是指在整個農業生產過程中被丟棄的有機類物質，主要包括秸稈、尾菜和畜禽糞便等［1]。中國已經成為農業廢棄物產出量最大的國家，而絕大數農業廢棄物沒有作為一種資源利用，隨意丟棄或者通過焚燒排放到環境中，對生態環境造成了極大影響［2]。研究農業固廢棄物處理現狀及發展路徑是解決環境問題、實現可持續發展的重要手段［3]。農業固體廢棄物是有機固體廢棄物的重要組成部分，目前主要通過填埋、焚燒、熱解、沼氣工藝和好氧堆肥等方式對其進行資源化處理［4]。

秸稈好氧堆肥是在有氧條件下將有機物質通過微生物的作用分解成腐殖質并形成穩定產品的過程［5]。堆肥是目前一種廣泛使用的通過微生物群落降解有機質的方法，從堆肥中獲得的堆肥產品含有作物必須的營養物質和有機物質，可作為土壤改良劑改善土壤結構。其中微生物在這個過程中起著至關重要的作用［6]。

雖然堆肥中的土著微生物群落通常能成功進行堆肥，但是因為該過程進行的速率與能夠作用于木質纖維素的微生物的比例直接相關，所以木質纖維素的降解成為影響堆肥腐熟時間的主要限速步驟［7]。木質纖維素中的纖維素是一種難以降解的物質，不易被微生物利用。然而有的微生物則可以分泌幾種類型的纖維素酶，包括纖維素酶、外切葡聚糖酶（如FPase）和木聚糖酶等［8]。大量研究表明，接種可以分泌纖維素酶的外源微生物，如細菌和真菌，可以加速堆肥過程中纖維素的生物降解［9]。

劉曉梅［10]采用纖維素剛果紅水解圈法、濾紙條降解實驗和纖維素酶活力測定，在杏鮑菇菌渣中篩選出3株高效降解纖維素的菌株（BC11、BC12、FB7），經分子鑒定FB7為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；BC12為叢毛單胞菌屬（Comamonassp.）的一種；BC11為白色鏈霉菌（Streptomyces albus）。Han［11]以纖維素為唯一碳源從咖啡外果皮分離得到38株細菌和18株放線菌，并對所分離的菌株進行了纖維素酶活的測定，從中優選出了酶活性較高的菌株。目前分離的具有纖維素降解能力的細菌較多，主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單孢菌屬（Pseudomones）、梭菌屬（Clostridium）、纖維單孢菌屬（Cellulomonas）［6，12]。目前已知能有效利用纖維素的放線菌主要有纖維放線菌（Actinomyces cellμlosae）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、熱單孢菌屬（Thermomonospora）等［10]，然而，當前纖維素降解菌株的積累仍然不足，農業固態廢棄物依然在世界各地造成一定的污染和資源浪費。為滿足現代農業發展中農業固態廢棄物無害化、資源化的需要，亟待挖掘更多更為高效的纖維素降解菌株資源。

本研究擬以玉米秸稈為材料進行好氧堆肥，旨在通過堆肥過程有針對性地選擇馴化纖維素降解菌株，進一步依此堆肥產物對其中優勢纖維素降解菌株進行分離培養，以期篩選獲得具有高效纖維素降解能力的菌株。本研究擬豐富纖維素降解菌株資源，并檢測菌株活性指標，旨在為下一步菌株在秸稈好氧堆肥過程中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 采集泰安地區玉米秸稈堆肥樣品，將其放冰盒運回實驗室，4℃冰箱保存備用。

1.1.2 培養基 CMC培養基羧甲基纖維素鈉（CMCNa）10.0 g，K2HPO41.0 g，NH4NO31.0 g，CaCl20.02 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，FeCl3·6H2O 0.05 g，瓊脂 20.0 g，蒸餾水1 000 mL；剛果紅培養基：CMC-Na 2.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，（NH4）2SO4 1.0 g，剛果紅0.1 g，瓊脂 20.0 g，蒸餾水1 000 mL；復篩培養基：CMC-Na 5.0 g，KH2PO41.0 g，NaNO33.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeCl3·6H2O 0.01 g，蒸餾水 1 000 mL；濾紙降解培養基：（NH4）2SO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g， 酵 母 膏0.1 g，濾紙條（1 cm×6 cm）3條/三角瓶，蒸餾水1 000 mL；；保藏培養基：LB培養基：蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，瓊脂 20.0 g，蒸餾水 1 000 mL；秸稈降解培養基：小麥秸稈烘干剪成1 cm左右的段狀，段狀秸稈10 g，赫氏奇無機鹽培養液1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離與純化 活化菌種 取1 g堆肥樣品用無菌水進行梯度稀釋，取10-4，10-5，10-6梯度的稀釋液100 μL涂布于CMC-Na培養基平板上，每個稀釋度3個重復，置于28℃的恒溫培養箱培養5-7 d，根據以CMC-Na為唯一碳源的培養基中菌落的直徑來初步評估菌株對纖維素的降解利用效果，選取直徑較大的菌株進行分離純化；待生長旺盛后用1 mg/mL剛果紅染色劑染色20 min后，棄去染液，加入1 mol/L氯化鈉溶液，洗滌1-2 min，保留降解圈較大的纖維素降解菌，測量菌落直徑（d）和降解圈直徑（D），通過計算D/d的值來確定纖維素降解能力較強的菌株；三區劃線純化并保存。

1.2.2 菌種鑒定 菌株形態學觀察及生理生化鑒定：將純化后的菌株活化，用無菌牙簽挑取適量菌苔，在CMC-Na平板上，進行三區劃線，于28℃下倒置培養3-5 d，至平板上長出清晰菌落，觀察菌落形狀、大小、邊緣、表面、隆起形狀透明度及菌落顏色等形態特征。生理生化測定參照東秀珠編《常見細菌系統鑒定手冊》［13]。

分子鑒定［14]：將有3株纖維素降解菌進行DNA的提取，以其為模板，以16S rDNA通用引物27F和1 492R引物進行擴增，得到1.5 kb的基因片段，將測序序列在NCBI進行BLAST比對，根據比對結果將所得基因的序列利用MEGA7.0進行多重序列比對并構建系統發育樹。

1.2.3 纖維素酶活的定量測定 將3株菌的單菌落分別接種于LB液體培養基中培養，然后取出500 μL接種于50 mL的發酵培養基中，28℃恒溫搖床振蕩培養1 d后，每天定時取樣測定發酵液的酶活力，連續測定5 d。

粗酶液制備：將上述產酶培養基中恒溫培養的液體發酵液經10 000 r/min離心15 min后，取上清液即為粗酶液。葡萄糖標準曲線：葡萄糖與木聚糖標準曲線的繪制：向7個25 mL具塞試管中分別依次加入1.6 mL、1.5 mL、1.4 mL、1.3 mL、1.2 mL、1.1 mL和l.0 mL，pH5.5的磷酸緩沖液，同樣依次加入1 mg/mL的葡萄糖與木聚糖溶液0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL和1.0 mL，最后每個試管中均加入3 mL的DNS，用Excel表格繪制葡萄糖與木聚糖標準曲線。

酶活力按國際單位的定義是：每分鐘催化水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個酶活力單位U。

酶活力的測定：將1 mL的1%CMC-Na、1%木聚糖溶液和2片1×1 cm的濾紙片分別加入到25 mL具塞試管中，37℃水浴10 min，再加入1 mL適當稀釋的粗酶液，搖勻，于此溫度下準確反映30 min后，迅速加入DNS試劑3 mL，在沸水浴中煮沸5 min，流水沖洗迅速冷卻，用蒸餾水定容到25 mL，在540 nm波長測吸光值，對照管中添加熱滅活酶液［15]。

1.2.4 濾紙崩解實驗 使用三角瓶液體發酵的方法研究各菌株的降解效果。每個三角瓶分裝100 mL產酶液體培養基并加入3條1×6 cm的濾紙條，以不接菌作為空白對照，其余處理加入待測菌株的菌懸液，混勻后置于恒溫培養，定期觀察濾紙條的形態變化。

1.2.5 秸稈降解 將3株菌株分別按1%的比例接種至小麥秸稈段無機鹽液體發酵培養基中，以接種等量無菌水為空白對照，在搖床溫度37℃、轉速180 r/min條件下液體發酵7 d。液體發酵降解結束后，將稻稈降解殘余物在100目的過濾網內用大量清水沖洗，除去附著菌體和可溶性物質，在105℃條件下烘干至恒重，同時稱取秸稈剩余物干重，計算降解率。秸稈相對降解率=（m0-m1）/m0×100%（m0為對照組秸稈剩余物干重，m1為處理組秸稈剩余物干重）。

2 結果

2.1 菌種的分離和純化

以玉米秸稈堆肥樣品，利用剛果紅染色法初步獲得43個具有纖維素降解功能的分離物。將分離得到的分離物經剛果紅平板實驗得到透明圈，通過計算透明圈和菌落直徑的比值（D/d）來初步測定降解纖維素能力較強的菌株。通過測量得到12株降解能力較大的菌株（表1）。

2.2 濾紙崩解實驗

由于菌株的降解纖維素的能力體現在分泌纖維素酶的綜合酶活力水平上，所以實驗采用濾紙條崩解實驗進行進一步的復篩，根據濾紙最終降解的程度來篩選優勢菌株，根據實驗結果（圖1），在培養3 d條件下，菌株GD16可以完全將濾紙條降解為糊狀，菌株C31可將濾紙條崩解為近似糊狀，菌株C37可將濾紙崩解為不定形狀，菌株C42和T5C2效果稍差，可將濾紙條邊緣崩解。與對照相比，這5株菌均具有崩解濾紙的效果，其中菌株菌株GD16和C31的崩解效果十分顯著，而且僅3 d就可以將濾紙條完全降解，保存菌株C31、C37和GD16用作接下來的實驗。

表1 纖維素降解菌初篩結果

圖1 濾紙崩解實驗效果圖

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌株形態學鑒定及生理生化分析 將3株菌株于CMC-Na平板上三區劃線，待長出單菌落后，觀察菌落形態。經觀察發現菌株C31在平板上（圖2-A）呈圓形，表面干燥，菌落為灰色。中央環狀凹陷，外緣有同心輪紋，邊緣略呈不規則波紋狀。革蘭氏染色結果為陽性（圖2-B）。生理生化鑒定結果如表2所示，接觸酶、葡萄糖反應為陽性，明膠液化、解淀粉反應為陰性。菌株C37在CMC-Na培養基上單菌落形態（圖2-C）為扁平、圓形，表面干燥，菌落為白色。革蘭氏染色結果為陰性（圖2-D）。

表2 纖維素降解菌生理生化特征

圖2 纖維素降解菌的菌落形態和革蘭氏染色

生理生化鑒定結果如表2所示，能利用淀粉、乳糖和蔗糖等碳源。菌株GD16在LB平板（圖2-E）上呈白色，革蘭氏染色呈陽性（圖2-F），桿菌，接觸酶、解淀粉反應呈陽性。孔雀綠染色（圖2-G）顯示產芽孢，桿菌，接觸酶、解淀粉反應呈陽性。

2.3.2 纖維素降解菌的分子生物學鑒定 根據比對結果將所得基因的序列利用MEGA7.0進行多重序列比較并構建系統發育樹（圖3）發現，C31與放線菌（Streptomyces drozdowiczii）相似性最高，C37與黃麻鏈霉菌（Streptomyces corchorusii）親緣關系較近，GD16經鑒定與類芽孢桿菌（Paenibacillus pabuli）親緣關系較近。

將濾紙條崩解實驗得到的3株菌，采用DNS法測定菌株的產木聚糖酶活性、濾紙酶活性和纖維素酶活性（圖4）。由結果可知，C31的3種酶最大酶活性均相對較高分別為8.5 U/mL、4.8 U/mL和3 U/mL，GD16的3種纖維素相關酶活中的木聚酶活性相對較高，高達23 U/mL，而菌株C37的3種纖維素相關酶活均較低，分別為2.5 U/mL、3 U/mL和2.3 U/mL。

2.4 酶活的定量測量

圖3 纖維素降解菌株16S rRNA基因系統發育樹

圖4 不同菌株不同纖維素酶活

圖5 不同菌株纖維素酶活變化

菌株C31、菌株C37 和菌株GD16的纖維素酶活變化趨勢呈現先上升后下降的趨勢（圖5）。在第4天時3個菌株的纖維素酶活均達到最大，分別為2.3 U/mL、3 U/mL 和 2.3 U/mL。其中菌株C31纖維素酶活上升速度相對較快，而菌株GD16的纖維素酶活相對于菌株C31和菌株C37較低。

在整個培養過程中，菌株C31、C37和GD16濾紙酶活性均呈現先上升后下降的趨勢（圖6），其中菌株GD16的濾紙酶活性在第3天達到最大值2.3 U/mL，菌株C37和菌株C31的濾紙酶活性在第4天達到最大值，分別為2.5 U/mL和3 U/mL。

菌株C31、菌株C37和菌株GD16的木聚糖酶活變化與它們的濾紙酶活性和纖維素酶活變化趨勢相似，即先增后降（圖7）。菌株GD16的酶活在第2天達到最大，為23 U/mL，C31和C37分別在第5天和第4天達到最大值分別為8.5 U/mL、3 U/mL。

2.5 秸稈相對降解率

為直觀評價3株菌對秸稈的降解能力，對3株菌的秸稈降解率測定結果如圖8所示。其中菌株C31的秸稈降解能力在3株菌中表現最優，其在無機鹽秸稈發酵培養基中28℃條件下培養7 d后，秸稈降解率達20%；其次為C37，其秸稈相對降解率為9%。GD16的秸稈降解率與C37相近，為8.2%。

圖6 不同菌株濾紙酶活變化

圖7 不同菌株木聚糖酶活變化

圖8 不同菌株秸稈相對降解率

3 討論

具有纖維素降解功能的微生物在堆肥效率方面起著至關重要的作用，其中放線菌在堆肥過程中的微生物群落中也發揮著重要的作用［16]。盡管放線菌的生長速度比細菌慢，但放線菌可能具有更重要的特性。例如，耐熱性和對極端環境的適應性等［17]。本研究從秸稈堆肥樣品中篩選得到了3株纖維素降解菌株，其中有2株放線菌和1株類芽孢桿菌。這也證明了放線菌具有降解纖維素的能力。此外，孫曉萌等［18]證實了放線菌將木質纖維素分解成可溶性碳水化合物的能力。并且鏈霉菌屬微生物分泌的纖維素酶與木聚糖酶的pH耐受性和溫度穩定性最好，這些酶在堿性、高溫環境中仍然具有較高酶活。細菌菌株一般是以大規模的繁殖來表現其自身的生物降解作用，同時是和多種微生物菌株的共同作用，才能實現較好的秸稈降解效果［19]。細菌酶活力較低，但細菌在厭氧條件下產生的纖維素酶在中、堿性環境下發揮作用，正好與有氧條件下真菌產生的偏酸性纖維素酶互補。此外，芽孢桿菌因具有較好的耐堿、耐高溫、耐酸能力而受到研究者的普遍關注［20]。本研究篩選得到的GD16是一株可產芽孢的類芽孢桿菌，豐富了纖維素降解菌資源，為纖維素降解菌在秸稈堆肥中的開發利用奠定了基礎。

為了提高接種效率，一般用于堆肥的接種物通常選擇具有一種或幾種酶能力的菌株組成［21]。本研究對這3株菌進行了濾紙酶活性、纖維素酶活性和木聚糖酶活性連續5 d的定量測量。結果顯示這3株纖維素降解菌都具有3種纖維素降解酶活，但是在不同酶活的大小卻有所差異，在纖維素酶活中，菌株C31的纖維素酶活是最大的，可達到4.8 U/mL；其次是C37和GD16，分別為3.0 U/mL、1.9 U/mL。在濾紙酶活中，C31的濾紙酶酶活是最大的，可達到3 U/mL。在木聚糖酶活中GD16的木聚糖酶酶活性最大，高達23 U/mL。這可能也是菌株GD16在濾紙崩解實驗中效果最好的原因。此外，王賢豐等［22]從海水中篩選出高效甘蔗渣纖維素降解地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），纖維素酶活力達到2.80 U/mL；陳珊等［23]從長白山森林的土壤中篩選出一株纖維素降解菌，經鑒定為地衣芽孢桿菌，纖維素酶活力為1.82 U/mL。本研究篩選得到的3株菌在纖維素酶活方面均高于這2株地衣芽孢桿菌。表明本研究所篩選的菌株具有一定的應用價值。

本研究中對篩選的纖維素降解菌進行了秸稈相對解率的測定，通過秸稈降解率的測量可以更加直接的觀察菌株實際的應用情況，結果顯示菌株C31的秸稈降解率均高于菌株C37和菌株GD16，這也與纖維素酶活測定結果相對應。

4 結論

針對蔬菜廢棄物好氧堆肥的特點從自然界中篩選優良的纖維素降解菌。采用篩選培養基對不同樣品進行纖維素降解菌株分離，獲得具有纖維素降解能力的菌株。通過羧甲基纖維素鈉水解圈法、濾紙條崩解試驗和纖維素酶活測定等對獲得的菌株復篩，獲得3株高效纖維素降解菌株，經鑒定菌株C31為放線菌、菌株C37為黃麻鏈霉菌，菌株GD16為類芽孢桿菌。