麻山藥不同生長時期根際土壤微生物多樣性及群落結構特征

康捷 章淑艷 韓韜 孫志梅

（1. 河北省微生物研究所，保定 071051；2. 河北農業大學，保定 071000）

根際土壤是指處于植物根際周圍受根系生長直接影響的土壤，根際微生物是受植物影響最大的土壤微生物群體，與植物的生長發育關系密切［1]。根際微生物群落結構的變化對土壤中物質和能量的循環、有機質的分解與合成等方面產生重要影響［2]。研究表明，影響根際微生物群落結構變化因素有很多，不同植物間、同一植物的不同基因型，甚至同一植物的不同生長期其根際微生物的數量、種類也有很大差別［3]。根際分泌物為根際微生物的生長提供營養和能源物質，其對微生物的數量、種類、分布及微生物的生長都有一定的影響［4]。土壤微生物從各個方面影響著植物的生長發育，土壤微生物區系的動態平衡是保證土壤健康的重要標準，只有健康、良性循環的土壤生態環境才能保證植物的健康生長。有些根際微生物可以產生激素類物質促進土壤有機質分解、誘導植株增加抗性等，或者通過爭奪營養、占領生態位等方式抑制病原菌的生長來間接促進植物的生長［5]。根際微生物群落結構失調，可能會導致病原菌數量的增加，從而使作物減產。因此研究不同作物土壤微生物的變化或同一作物不同生長時期土壤微生物的情況具有重要意義。

一直以來由于大多數的微生物在營養培養基中可培養性低或不能被培養的缺陷嚴重制約了微生物多樣性的研究。隨著分子生態學研究技術的發展，以 DNA 為基礎的分子分析技術，如PCR-RFLP、DGGE/TGGE、SSCPP 等可以克服傳統培養技術的限制，從分子水平來直接分析微生物群落結構的變化，然而這些技術存在檢測限低、工作量大等缺陷［6]。高通量測序等非傳統培養方法成為了研究土壤微生物多樣性和群落結構特征的有力工具，其具有速度快，耗時少，成本低廉，準確度高等優點，能更真實地反映環境中群落的特點。目前，高通量測序技術主要是 Illumina、Roche454 和 Life Technologies 等公司開發的測序平臺［7]。

張亮等［8]研究了不同品種百合在不同生育期根際土壤微生物種類、數量的變化規律，結果顯示在生育期內，細菌數量最多；其次為真菌，放線菌。孫建波等［9]通過對香蕉不同生長期根際土壤細菌多樣性和數量的研究，結果顯示，細菌數量呈現先增加后減少的趨勢，多樣性逐漸減少。仝利紅等［10]研究草莓不同生育期根區微生物多樣性及動態變化，結果表明，根區可培養微生物總量從開始生長期到盛果期逐漸增多，細菌群落多樣性指數和豐度在生長末期達到最高，而真菌在現蕾期達到最高。常穎萃等［11]測定了竹蓀不同生育期內土壤中細菌、真菌、放線菌3種微生物的數量，研究了土壤微生物動態變化規律。胡延森等［12]對黃瓜根際主要微生物類群在不同生育期變化的研究，結果表明，根際微生物的數量一般是由栽種時開始升高，到花期或盛果期時達到最高峰，生長后期有下降趨勢，同時黃瓜生長對某些種群數量分布有一定影響，也說明這些類群微生物可能是對黃瓜花期生長起特殊作用。

目前尚未有報道對麻山藥不同生長時期根際土壤微生物多樣性及群落結構特性的研究，本研究以麻山藥為實驗材料，采集麻山藥苗期、花期和收獲期的根際土樣。運用 Illumina 測序平臺對土壤樣品細菌16S rDNA和真菌ITS rDNA 進行了高通量測序，通過比較不同時期麻山藥根際土壤微生物多樣性、均勻度和優勢種群集中度的變化及真菌、細菌量的變化，探究3個不同生長期的麻山藥根際土壤細菌群落結構多樣性及變化，從而揭示麻山藥不同生長期微生物群落特點及變化規律，這對評價生長期對土壤微生物多樣性的影響具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所選地塊為河北省蠡縣小鐘麻山藥農業合作社的麻山藥地，第2年種植。山藥品種，紫藥。播前土壤有機質含量7.12 g/kg、堿解氮28.45 mg/kg、速效磷6.73 mg/kg、速效鉀63.37 mg/kg。測定方法參照文獻［13]。

在2016年5月1日，7月18日（苗期），8月24日（花期）和10月15日（收獲期）進行樣品采集，在試驗地內選取5個取樣點，撥開麻山藥根系周圍的表土層，在離麻山藥根基軸表面1-5 mm處，用抖落法獲取其上黏附的土壤作為根際土壤［14]。不同時期的5個土樣混合并除去較大根系等雜物后作為該時期土壤的一個樣品，每組做3個平行，裝于無菌牛皮紙袋中帶回實驗室。新鮮的土壤置-20℃冰箱冷凍保存，用于后續微生物多樣性的測定。

1.2 方法

1.2.1 土壤DNA提取與檢測 采用土壤基因組DNA提取試劑盒（離心柱型，天根生化科技有限公司）提取土壤總DNA，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（普通離心柱型，天根生化科技有限公司）進行純化，經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測及微量核酸蛋白檢測儀檢測濃度后置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 基因擴增 PCR反應體系：DNA模板1 μL，10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPS 4 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，上下游引物各1.5 μL，無菌超純水補充至 50 μL。

以30-50 ng DNA為模板，使用金唯智設計的PCR引物擴增原核生物16S rDNA上包括 V3、V4 及V5的3個高度可變區。采用包含CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT序列的上游引物和包含GGACTACNVGGGTWTCTAATCC序列的下游引物擴增V3和V4區，采用包含GTGYCAGCMGCCGCGGTAA序列的上游引物和包含CTTGTGCGGKCCCCCGYCAATTC 序列的下游引物擴增V4和V5區。以5-50 ng DNA 為模板，PCR擴增真菌ITS rDNA上的 ITS2可變區。

擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性50 s，50-60℃退火50 s，72℃延伸1.5 min，30個循環；72℃延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1.2.3 高通量測序 高通量測序文庫的構建和基于I11umina MiSeq平臺的測序由GENEWIZ公司（Suzhou，China）完成。雙端測序得到的正反向reads 首先進行兩兩組裝連接，過濾拼接結果中含有N的序列，保留序列長度大于200 bp的序列。經過質量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列用于OTU分析，使用 VSEARCH（1.9.6）進行序列聚類（序列相似性設為97%），比對的16S rRNA參考數據庫是Silva 119，ITS rRNA參考數據庫是UNITE ITS database（https：//unite.ut.ee/）。 然 后 用 RDP classifier（Ribosomal databaseprogram）貝葉斯算法對OTU的代表性序列進行物種分類學分析，并在不同物種分類水平下統計每個樣本的群落組成。基于OTU的分析結果，采用對樣本序列進行隨機抽樣的方法，分別計算Shannon、Chao1等α多樣性指數，并作出稀釋曲線。通過層次聚類（Hierarchical clustering）中的非加權組平均法構建（Unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）進化樹。

2 結果

2.1 根際土壤細菌群落結構分析

2.1.1 麻山藥不同生長期土壤樣本細菌測序特性 由于高通量測序常常會出現一些突變等錯誤，對測序結果的原始數據進行優化處理，處理步驟及參數：將2條序列進行比對，根據比對的末端重疊區進行拼接，拼接時保證至少有20 bp的重疊區，去除拼接結果中含有N的序列；去除引物和接頭序列，去除兩端質量值低于20的堿基，去除長度小200 bp的序列；將上面拼接過濾后的序列與數據庫進行比對，去除其中的嵌合體序列（Chimera sequence），得到最終的有效數據。

對于細菌群落來說，樣品在不用生長時期統計結果如表1所示。

隨著樣品量的加大，可能出現測序檢測到的物種種類隨之增加的狀況，稀釋曲線（Rarefaction curve）是調查樣品的物種組成和預測樣品中物種豐度的有效工具，在生物多樣性和群落調查中，常用于判斷樣品量是否充分及估計物種的豐富度。從圖1和圖2可以看出，麻山藥不同生長期樣品對應的稀釋曲線均基本趨于平緩，說明取樣基本合理，細菌（或真菌）群落結構的置信度較高，能比較真實地反映出樣品在不同生長時期的細菌（或真菌）群落。

2.1.2 麻山藥不同生長期土壤細菌多樣性指數分析 群落生態學中，α多樣性主要關注單樣本的多樣性分析，可以反映微生物群落中物種的數目，通過一系列統計學指數的分析來估計環境群落的物種豐度和多樣性。由表2可以看出，不同生長期細菌的Good's Coverage指數都接近100%，說明樣本序列中沒有被測出的概率很低，在該水平上的測序結果能夠反映出所測樣本中細菌的真實情況。計算菌群豐度的指數有ACE和Chao，計算菌群多樣性指數有Shannon和Simpson，由表2可以看出，不同生長期土壤中細菌豐度和多樣性之間沒有顯著性差異。

2.1.3 不同生長期細菌種類分布 使用RDP classifier對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，從而獲得每個樣品在各個水平對應的群落組成。如表3所示，不同時期的土壤樣品中檢測到12個以上細菌門，其相對豐度均大于1%，說明這12個門的細菌在本實驗中所取的土壤細菌群落結構組成中占主要地位。

圖2 不同時期土壤樣品真菌稀釋曲線

表2 不同時期土壤細菌的α-多樣性指數

表3 主要細菌門的相對豐度

2.1.4 不同生長期主要細菌物種分布 與Silva數據庫相對比，獲得各樣品細菌在門水平下Top30的物種分布圖。如圖3所示，結合上表分析得出，不同生長期土壤中變形菌門均為最優菌群，苗期、花期和收獲期所占的比例分別達到35.22%、29.44%和28.30%，隨著種植時間的延長，其所占的比例呈下降的趨勢，即在麻山藥苗期所占的比例最高，較其他兩組都有顯著性差異（P＜0.05），花期和收獲期兩組之間沒有顯著性差異；其次為酸桿菌門，兩者之和在不同生長期所占的比例之和超過了50%，苗期、花期和收獲期酸桿菌門所占的比例分別為21.03%、24.85%和23.28%，在麻山藥花期土壤中酸桿菌門達到最高。此外，放線菌門、芽單胞菌門和擬桿菌門在麻山藥種植中不同生長期內均為優勢菌群（所占比例超過5%），其中擬桿菌門同樣在麻山藥苗期達到最高，為9.15%，比花期和收獲期高3.69和3.75個百分點，有顯著性差異（P＜0.05）。其他菌群（所占比例超過1%，但低于5%）中，硝化螺細菌門所占比例在花期接近5%，顯著高于其他兩個時期，而綠彎菌門和浮霉菌門均在收獲期所占比例最高。

圖3 不同時期土壤樣品在門水平前30的細菌物種分布圖

2.1.5 不同生長期細菌群落相似度聚類樹分析 樣品聚類分析利用各樣品序列間的進化信息來比較在特定的進化譜系中是否具有顯著的微生物群落差異，使用非加權組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）將樣品進行聚類，結果（圖4）顯示，不同生長時期土壤中細菌組成可以分為兩大類，圖4中苗期和花期土壤的細菌群落組成具有很高的相似性，苗期第1組和第3組具有很高的相似性，并與第2組的土壤樣品聚為一類，花期第3組和第2組具有很高的相似性，并與收獲期第一組的土壤樣品聚為一類，同時這6組土壤樣品的趨同性較高，而收獲期第3組和第2組樣品具有很高的相似性，并與花期第1組的土壤樣品聚為一類。由此可以得知，麻山藥不同生長時期的土壤細菌群落多樣性之間雖然有不同程度的差異，但是苗期和花期兩組之間群落組成結構相似性較高，與收獲期之間也存在趨同性。

2.2 根際土壤真菌群落結構分析

2.2.1 麻山藥不同生長期土壤樣本真菌測序特性 對真菌群落來說，樣品在不同生長時期過濾后統計結果如表4所示。

圖4 細菌群落結構UPGMA聚類圖

表4 不同時期真菌樣本統計數據

2.2.2 麻山藥不同生長期土壤真菌多樣性指數分析 由表5看出，不同生長期真的Good’s Coverage指數都接近100%，說明樣本序列中未被測出的概率很低，在該水平上的測序結果能夠反映出所測樣本中真菌的真實情況。麻山藥不同生長期土壤中真菌豐度之間同細菌一樣無顯著性差異，但表現為收獲期＞花期＞苗期。由表5中Shannon和Simpson指數，同樣真菌多樣性也表現為收獲期＞花期＞苗期，且收獲期和花期的多樣性指數顯著高于苗期。由此可見，麻山藥種植過程中，不同生長期內真菌變化較大，隨著種植時間的延長，真菌豐度和多樣性明顯提高，說明真菌數量也有明顯提高。同時，在不同生長發育時期，麻山藥根系生理活動代謝活動的強弱也不同，生長后期會出現特定菌屬所占比例顯著高于其他時期，這與作物生長所需有關。

2.2.3 不同生長期真菌種類分布 同樣使用RDP classifier對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，獲得每個樣品在各個水平對應的群落組成。如表6所示，不同時期的土壤樣品中檢測到13個以上真菌屬。可見，這13個屬的真菌在本實驗中所取的土壤真菌群落結構組成中占主要地位。

2.2.4 不同生長期主要真菌物種分布 對比Silva數據庫，各樣品真菌在屬水平下Top30的物種分布圖如圖5所示。結合上表分析得出，與細菌不同的是不同生長期土壤中最優真菌菌屬不同，放射毛霉屬是麻山藥苗期最優菌屬，所占比例為13.8%，而花期和收獲期的最優菌屬為被孢霉屬，所占比例分別為6.97%和7.86%。根霉屬在麻山藥種植初期，即苗期所占的比例最高，達2.51%，比花期和收獲期高2.11和1.89個百分點，差異顯著（P＜0.05）。肉坐菌屬、毛殼菌屬和綠僵菌屬，在麻山藥的花期所占比例最高，分別為2.47%、1.16%和1.02%，而其他兩個時期的比例卻只有不到1.0%甚至更低，有顯著性差異（P＜0.05），毛殼菌屬作為生防菌在防治植物病害方面最為突出，是腐生子囊菌中數量最多和意義較大的類群之一。被孢霉屬、接合菌屬、翅孢殼屬和球囊霉屬所占的比例在麻山藥種植期間呈上升趨勢，即在收獲期最高，分別達到7.86%、1.25%、1.26%和1.12%，顯著高于其他兩個時期，花期和收獲期的比例均不到0.5%（被孢霉屬除外）。

表5 各處理組土壤真菌的α-多樣性指數

表6 主要真菌屬的相對豐度

2.2.5 不同生長期真菌群落相似度聚類樹分析 不同生長時期麻山藥土壤樣品真菌群落結構聚類，結果（圖6）顯示，不同時期土壤中真菌組成分為兩大類，花期第3組土壤樣品與第2組之間具有很高的相似性，并與苗期第3組土壤樣品聚為一類；收獲期第2組土壤樣品和第3組之間有很高的相似性，并與第1組土壤樣品聚為一類，這6組樣品與苗期第2組樣品之間有較高的相似性，并與花期第一組樣品聚為一類；苗期第1組土壤樣品單獨聚為一類，與其余幾組之間真菌群落結構存在相對較大的差異性。

圖5 不同時期土壤樣品在屬水平前30的真菌物種分布圖

3 討論

土壤微生物區系是土壤質量的變化的主要因素之一，同時也決定了土壤是否健康，土壤微生物區系與許多土傳病害之間都有著密切的聯系，研究表明，土壤健康的顯著特征是土壤微生物生物量大、多樣性高和土壤微生物區系組成的動態平衡［15]。微生物培養計數作為傳統的分析方法在土壤微生物研究中具有重要作用，但是，傳統的分析方法不能反映其在土壤中的真實情況，需要采用新的方法進行研究分析［16]。隨著人們對微生物在農業生產中重要作用的認識不斷加深，用土壤微生物學特性來評價土壤的健康程度和質量日漸被認可［17]，用高通量手段測定的多樣性指標可以作為評價土壤健康程度的一種指標，與傳統的培養測數法相比，都是一種手段。

圖6 真菌群落結構UPGMA聚類圖

本研究運用高通量測序技術探究3個不同生長時期麻山藥根際土壤中細菌和真菌群落結構變化，計算菌群豐度的指數有ACE和Chao，由Chao于1984最早提出［18]，在生態學中常用來估計物種總數，計算菌群多樣性的指數有Shannon和Simpson，辛普森（Simpson）多樣性指數，由Edward Hugh Simpson于1949提出，在生態學中常用來定量的描述一個區域的生物多樣性，其值越高，說明群落多樣性越高［19]。通過對麻山藥不同生長期根際土壤分析可知，不同生長期土壤中細菌豐度和多樣性之間沒有顯著性差異，變形菌門和酸桿菌門是麻山藥根際細菌群落的最優菌群。而真菌在不同生長時期變化趨勢明顯，從開始生長期到收獲期逐漸增多，在收獲期時多樣性指數和豐度達到最高，放射毛霉屬和被孢霉屬始終是真菌群落的最優菌群。結合其他優勢菌群在不同生長時期的明顯變化，可以看出，這些菌群跟麻山藥生長發育密切相關。這表明麻山藥的生長期對根際土壤細菌和真菌群落結構均有重要的影響。

有研究表明，真菌是參與土壤有機物質分解過程中的主要成員之一，它們分解纖維素、半纖維素、木質素、單寧等化合物的能力遠大于細菌，從而有利于改良土壤結構，提高土壤肥力，促進作物生長［20]。研究顯示真菌數量在收獲期達到最高值，表明麻山藥種植后期根際生理代謝活動加強，其產生的代謝產物僅有利于某些特定菌群的生長，從而顯著高于其他時期，而這些優勢菌群對其他菌群具有競爭優勢，結構造成部分真菌成為優勢菌群并大量繁殖，另外一些菌群則在競爭中被抑制。早在1954年，Martin和Moorc［21]發現，燕麥種子被球毛殼和螺卷毛殼侵染后，會使谷物、大麥等作物的幼苗免受鐮刀菌的再侵染［22]，這點與測定結果相一致，被孢霉屬、接合菌屬、翅孢殼屬和球囊霉屬所占的比例在麻山藥種植期間呈上升趨勢，在收獲期最高，說明這幾種真菌在麻山藥種植后期發揮作用。麻山藥種植不同時期內真菌含量及所占的比例各不相同，說明不同類別的菌屬在不同時期所起的作用不同，這跟作物生長所需有關。

研究同時發現，麻山藥不同生長時期所有樣品中共包含29個細菌門，其中變形菌門和酸桿菌門的相對豐度最高，兩者在不同時期所占比例均超過了50%；其次是放線菌門、芽單胞菌門和擬桿菌門，這3大門類分別所占的比例均超過了5%。袁紅朝等［23]分析稻田土壤細菌的群落結構，發現變形菌、酸桿菌和綠彎菌是優勢細菌；其次是放線菌。牛世全等［24]分析河西走廊地區鹽堿土壤群落結構，發現變形菌門含量最高，占 28.56%；其次是放線菌門，占 17.2%。楊菁等［25]發現降香黃檀不同混交林土壤細菌多樣性主要菌群有變形菌門、酸桿菌門、放線菌門及綠彎菌門。結果均與本研究相一致。而真菌相對豐度在不同時期變化顯著，苗期、花期和收獲期分別包含有64、67和75個真菌屬，其中放射毛霉屬和被孢霉屬是真菌群落的最優菌群，兩者在不同時期所占的比例約15%，結合其他優勢菌群在不同生長時期的明顯變化，可以看出，這些菌群在不同生長時期所占的比例有所不同，可能與作物生長發育有關。

4 結論

本文研究了麻山藥在苗期、花期和收獲期根際土壤微生物群落結構的變化，變形菌門和酸桿菌門是麻山藥根際細菌群落的最優菌群，放射毛霉屬和被孢霉屬是真菌群落的最優菌群，同時真菌數量在收獲期達到最高值，可以看出，這些菌群含量不同與麻山藥生長發育密切相關。因此，為后續在研究麻山藥土傳病害的方面提供理論依據，可通過研發土壤菌劑調節劑的手段，從而改變土壤微生物菌群的組成，使其通過細菌與細菌之間、真菌與真菌之間或細菌與真菌之間的相互作用，達到抑制病原微生物的生長，提高抗病性的目的。