固定化海洋脲酶制備及其在尿素廢水處理中的應用

劉長榮 張風麗 李志勇

（上海交通大學生命科學技術學院 微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

脲酶（Urease，EC 3.5.1.5）能夠催化尿素分解生成兩分子氨和一分子二氧化碳，自1926年Sumner從刀豆中分離出其晶體以來［1]，人們在大自然中眾多生物如植物、細菌、真菌、藻類及無脊椎動物均發現脲酶的存在，甚至游離于土壤作為土壤脲酶出現［2]。基于此，脲酶已被廣泛開發并應用于醫學檢驗、食品加工、農肥科學和環保監測等領域，尿素廢水處理便是其中之一［3]。

尿素作為主要的化肥種類之一，也是一種重要的化工原料。2018年，全球產量達1.691×108t，預計2019年將增長1.1%［4]。但尿素的生產避免不了尿素廢水，其中尿素的含量達750 mg/L［5]，若直接排放不僅造成了尿素的流失，還會污染環境，因此需要對其進行廢水處理。目前處理尿素廢水的方法有3種：化學熱力學水解法、微生物水解法及脲酶水解法。化學水解法反應需要在高溫高壓下進行，設備龐大且成本高，資源浪費大，特別是對低濃度尿素廢水的處理非常不合算［6]；微生物水解法雖然作用溫和，但是微生物在尿素廢水中難以生長，須經長期馴化及額外補料才能發揮作用［7]；而脲酶水解法操作簡便、反應條件溫和、費用低，處理過后的廢水經二次解吸脫氨能使殘余的尿素和氨達痕量，從而直接排放或用于鍋爐給水及循環水［6]。

游離酶不穩定，容易變性失活，且反應后難以分離回收以進行重復利用，因此通常將酶引入到合適的載體上進行固定化，使其在保持高效催化特性的同時，還具有可重復利用、操作穩定等優點［8]。目前酶的固定化方法主要有包埋法、吸附法、交聯法以及共價偶聯法，包埋法由于操作簡單、結合程度強、酶活損失小、費用低等優點，適合于大規模工業化處理［9]。

尿素廢水由于尿素及氨的存在，pH往往高于9.0，因此需要額外添加磷酸或者通入CO2來降低pH以達到常規脲酶的工作條件，同時開發耐堿的酶以適應尿素廢水環境或者尋求良好的固定化材料以提高酶的穩定性［3]也是解決辦法之一。有意義的是，相關研究已發現海洋來源的脲酶相對于陸地來源酶更具耐堿性［10-12]，但是目前的實驗材料大都集中于植物來源的中性或弱堿性脲酶［8]，因此有必要探究海洋源性脲酶在處理尿素廢水上具有的優勢。

本研究采用課題組從中國南海（18.42°N，109.97°E）海綿Siphonochalinasp.中分離得到的一株產堿性脲酶的海洋真菌Penicilliumsp.，該菌所產脲酶最適溫度和pH達55℃、8.5。在此基礎上，為進一步提高其耐熱及耐堿性，采用最簡單實用的包埋法進行固定化，對比了幾種不同材料的包埋效果，選擇最優的固定化脲酶裝柱運行，考察其處理尿素廢水的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

脲酶凍干粉（1 542 U/mg），本實驗室經細胞破碎、硫酸銨鹽析、Hitrap DEAE FF離子交換層析及Superdex 200 10/300 GL凝膠過濾層析、真空冷凍干燥所得；聚乙烯醇、明膠，Aladdin公司；海藻酸鈉，上海源葉生物科技有限公司；氯化鈣、硼酸，上海凌峰化學試劑有限公司；戊二醛，羅恩公司；尿素廢水（0.012 5 mol/L尿素，0.007 mol/L氨，自來水配置滅菌后使用）實驗室自制［3]。

酶標儀，BioTek公司；pH計，梅特勒-托利多公司；φ 2 cm×20 cm填料柱，業立生物科技（上海）股份有限公司；蠕動泵，上海青浦滬西儀器廠；培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 固定化方法

1.2.1.1 海藻酸鈉包埋法［13]取一定量的海藻酸鈉溶于適量去離子水中，于40℃水浴加熱攪拌使其充分溶解，待冷卻至室溫后將一定量的脲酶溶于其中，攪拌均勻并用注射器（針頭內徑1.54 mm）以恒定高度逐滴滴加至含一定濃度的CaCl2水溶液中，隨后將包埋了脲酶的海藻酸鈉- CaCl2凝膠顆粒置于4℃冰箱硬化過夜。硬化結束后用Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.5）洗滌3次，瀝干水分后置于4℃保存備用。

1.2.1.2 聚乙烯醇包埋法［9]將一定量的聚乙烯醇置于適量去離子水中充分溶脹，隨后于90℃水浴加熱攪拌30 min至充分溶解，冷卻至室溫后取一定量的脲酶溶于其中，攪拌均勻后用注射器針頭內徑1.54 mm）以恒定高度逐滴滴加至飽和硼酸溶液（用Na2CO3調pH至8.5）中，成型后置于4℃施以慢速攪拌過夜固化。固化結束后用Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.5）洗去表面殘留物質，瀝去水分后置于4℃保存備用。

1.2.1.3 明膠包埋法［14]用一定量的明膠溶于適量Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.5）中并于60℃水浴加熱不斷攪拌1 h成澄清透明溶液，自然冷卻至室溫后稱取一定量的脲酶溶于其中，隨后用玻璃棒攪勻并倒入一次性平板中置于4℃固化30 min，待冷凝后切成4 mm×4 mm×4 mm 小塊，并泡入一定濃度的戊二醛溶液中室溫交聯一定時間。之后用Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.5）洗滌數次，除去水分后置于4℃保存備用。

1.2.2 酶活力測定方法 游離酶酶活力通過靛酚藍反應采用Berthelot比色法進行測定，具體方法見參考文獻［15]。而固定化酶酶活力測定則是將包埋顆粒置于含500 mmol/L尿素的Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.5）中于55℃振蕩孵育20 min，隨后取出400 μL反應液按游離酶酶活力測定的后續方法進行測定。

酶活力定義：在常壓、55℃、pH 8.5條件下，每分鐘分解1 μmol底物所需的酶量為一個酶活力單位。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 酶回收率測定 固定化酶回收率（%）=（固定化酶的總活力/用于固定化的脲酶凍干粉總活力）× 100%，通過測定單位質量固定化酶的酶活力（見1.2.2），求出固定化酶的總活力。

1.2.3.2 凝膠顆粒機械穩定性測定 參照文獻［9]，固定化顆粒的機械強度采用正面按壓法測量，隨機選取10個固定化顆粒，以2×5的排列方式蓋以載玻片，并用適量的砝碼逐級加壓于載玻片上，直至顆粒破裂，該壓力值表征固定化顆粒的機械強度。

1.2.3.3 穩定狀態動力學 酶的最適溫度及pH通過比較其在35-85℃范圍內或在pH 7-10.5梯度中反應后的酶活得出［15]；酶的溫度及pH耐受性通過測定其在35-85℃（pH 8.5）中保存半小時或pH 7-10.5（4℃）中保持6 h后的殘余酶活獲得［15]；酶的儲存穩定性通過測定酶在4℃、Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.5）中隨時間變化（每3 d一個點）的殘余酶活得出。

1.2.3.4 尿素降解率測定 尿素濃度根據二乙酰一肟法進行測定［15]：尿素降解率（%）=（反應前后溶液中尿素濃度差/原溶液中尿素初始濃度）×100%。

1.2.4 尿素廢水處理裝置的構建 將制備好的固定化脲酶顆粒填裝進φ 2 cm×20 cm的柱子中，連接蠕動泵調節流速，讓尿素溶液自上而下流過填料柱，整個裝置置于培養箱中，通過調節培養箱的溫度來改變填料柱的工作溫度，收集柱子下端流出的液體，并每間隔5 d測定尿素降解率及固定化脲酶殘余酶活。

2 結果

2.1 固定化參數確定及效果比較

三種包埋方法所制備的凝膠微球，如圖1所示。海藻酸鈉與聚乙烯醇包埋顆粒皆呈規則圓球狀，而明膠包埋法由于其制備方法的差異性，與前二者有明顯區別。海藻酸鈉包埋小球為無色透明狀，聚乙烯醇包埋小球呈白色，且相互之間有黏性，而明膠塊由于戊二醛的原因而呈黃色。本實驗以每種包埋方法所能達到最大酶回收率時作為最優條件，從而確定各參數值。

圖1 脲酶包埋顆粒效果圖

實驗中發現，海藻酸鈉濃度過高時難以溶解，而濃度過低時形成的凝膠微球拖尾導致形狀不規則，且易破碎變形，因此選擇的海藻酸鈉濃度（W/V）為1%、2%、3%、4%、5%和6%。鈣離子能與海藻酸鈉迅速發生離子交換從而生成凝膠，因此CaCl2濃度亦對包埋效果造成影響，預實驗表明，CaCl2濃度過低會導致凝膠強度變弱，酶回收率也比較低，而CaCl2濃度過高時酶回收率迅速下降，可能是鈣離子與脲酶發生作用所致，因此選擇CaCl2濃度為1%、2%、3%、4%、5%和6%。隨著所添加酶量的增大，固定化酶活力持續上升，但過高時酶回收率開始下降，說明此時載體已達到飽和，故選取的加酶量為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL和0.8 mg/mL。同樣，聚乙烯醇濃度過低時凝膠球不易成型，過高時溶液太黏稠稠且凝膠球易粘連，因此選取聚乙烯醇濃度為1%、2%、4%、6%、8%和10%。明膠包埋時，明膠濃度過低，所形成的凝膠機械強度明顯不夠，操作易破裂，過高時太黏稠易發生焦糊現象，而導致固定化酶活力明顯下降，因此選取明膠的濃度為5%、10%、15%、20%、25%和30%。固定化酶活力隨戊二醛濃度的增大而增大，說明酶在載體上的固載量增加了，但是過高時固定化酶活力呈下降態勢，因此選取戊二醛的梯度為0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%。交聯時間越長，固定化率越高，但過長時，固定化酶活下降，推測是偶聯的酶太多，使載體孔徑變小，底物不易于酶結合，從而降低了酶促反應，故選取的交聯時間為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和 3 h。

經正交實驗（表1），海藻酸鈉包埋法最終選取海藻酸鈉、CaCl2、酶/載體比例分別為2%、2%和0.5 mg/mL，其酶回收率及機械穩定性達到了61.47%、355 g；聚乙烯醇包埋法最優組合為8%聚乙烯醇及0.3 mg/mL酶/載體比例，酶回收率及機械穩定性達到了44.28%、470 g；明膠包埋法采用明膠濃度、戊二醛濃度、交聯時間、酶/載體比例為15%、1%、2 h、0.6 mg/mL時效果最佳，酶回收率及機械穩定性達66.51%、125 g。

表1 三種包埋方法最優條件

2.2 固定化脲酶性質分析

對3種固定化脲酶與游離脲酶就最適溫度、溫度耐受以及最適pH、pH耐受進行分析。如圖2所示，海藻酸鈉、聚乙烯醇、明膠固定化酶最適溫度分別為70、70及65℃，而游離酶在55℃時酶活力最大，且其在70℃時活性只有50%左右（圖2-A），游離酶經海藻酸鈉、聚乙烯醇、明膠固定化后最適溫度分別提升了15、15及10℃。此外，海藻酸鈉與聚乙烯醇固定化酶在35-85℃保存30 min后酶活力仍能保持在90%以上，基本無酶活損失，明膠固定化酶在高于65℃時殘余酶活力下降明顯，而游離酶在50℃以上時活性迅速喪失，在85℃反應30 min后海藻酸鈉、聚乙烯醇以及明膠固定化酶殘余酶活分別為95.45%、91.05%及36.66%，而游離酶只有12.58%（圖2-B），表明固定化酶尤其是海藻酸鈉和聚乙烯醇包埋顆粒比游離脲酶耐熱性有較大提升，能在相對高的溫度下進行催化反應。在不同的pH值緩沖溶液中分別對固定化酶和游離酶進行測定，結果顯示海藻酸鈉、聚乙烯醇、明膠固定化酶以及游離酶的最適pH分別為9.5、8.5、8.0和8.5，海藻酸鈉在pH 10.5時固定化酶活力能保持在90%以上，聚乙烯醇、明膠固定化酶大概在80%，而游離酶只有70%左右（圖2-C）；海藻酸鈉固定化脲酶在pH 7-10.5范圍內保持6 h，殘余酶活均在90%以上，聚乙烯醇固定化酶在pH 9.5以上時出現下降，而明膠固定化酶與游離酶耐堿性質類似，在pH高于8.5時快速失活（圖2-D），表明海藻酸鈉固定化酶比其他三者更具耐堿性，適合在堿性條件下工作。

2.3 固定化脲酶降解效率比較

從上文中可以看出，固定化脲酶比游離酶更耐熱，且海藻酸鈉固定化酶還具有一定的堿偏好性。因此更利于尿素廢水處理，但為了考察四者的工作效率，本實驗將固定化脲酶和游離脲酶分別置于尿素廢水中，在6 000 U/L脲酶濃度、70℃的條件下，測量其隨時間的尿素降解情況，結果如圖3所示，至2 h時游離脲酶基本失活，此后溶液中尿素濃度保持不變；明膠固定化酶性能相較于游離酶并沒有得到較大提升，其在3 h時失活，最終尿素降解率為24%；聚乙烯醇耐熱性耐堿性提升明顯，因此其處理下的尿素廢水中尿素濃度在不斷下降；而海藻酸鈉是四者中性質最穩定的，其處理樣本在2.5 h時尿素降解率能達到50%，且尿素濃度隨著時間延長而不斷下降。因此4種方法的工作效率由高到低依次為海藻酸鈉、聚乙烯醇、明膠固定化酶以及游離脲酶，選取海藻酸鈉固定化脲酶進行下一步試驗。

圖2 溫度和pH對游離脲酶和固定化脲酶的影響

圖3 游離脲酶與固定化脲酶的降解效率

2.4 海藻酸鈉固定化脲酶儲存穩定性

采用固定化酶技術進行尿素廢水處理存在的問題在于，固定化酶有一定的使用期限，需要定期進行更換。為了降低固定化酶生產成本以及應對突發情況需要對固定化酶進行預制備，并進行冷藏保存。因此本實驗將游離酶和海藻酸鈉固定化酶置于4℃冰箱保存，每3 d測定一次酶活，以測定兩者的儲存穩定性，如圖4所示，游離脲酶半衰期為20 d左右，而海藻酸鈉固定化酶半衰期為3個月以上，表明其穩定性顯著高于游離脲酶，可以進行大規模預制備。

圖4 游離脲酶與海藻酸鈉固定化脲酶儲存穩定性

2.5 利用海藻酸鈉固定化脲酶連續處理尿素廢水

利用1.2.4中搭建的尿素廢水處理裝置進行尿素廢水處理，為減少處理后的液體加熱解吸脫氨所需要的熱能，本實驗選擇70℃作為工作溫度。通過恒流泵調節尿素廢水的進樣速度，同時收集濾液測定銨濃度，從圖5可以看出，隨著流速的不斷增大，尿素轉化速度也在加大，但流速超過一定大小后，尿素轉化速度出現下滑，這可能是因為流速過大，使得尿素廢水在柱子中停留的時間過短，因而限制了脲酶對尿素的分解。圖中顯示當流速為19、20和21 mL/min時，三者尿素轉化速度相當，但流速為19 mL/min時尿素降解率是三者中最大的，為90.25%，因此選取19 mL/min作為工作流速。

圖5 工作流速選擇

為鑒定該裝置的處理效率，本實驗對其進行了跟蹤。如圖6所示，固定化酶在前35 d酶活在90%以上，基本與初始值一致，且尿素的降解率也維持在高水平。隨著時間的推移，固定化酶酶活及尿素降解率皆出現下滑，其中固定化酶半衰期為65 d，且此時的尿素降解率仍能達到50%左右。根據現行GB13458-2001《合成氨工業水污染物排放標準》中尿素含量規定（≤ 200 mg/L），其使用期限可達55 d，說明該裝置具有一定的工作有效性。

圖6 尿素廢水處理裝置連續運轉參數變化

3 討論

固定化酶回收率越大，其所固定的酶活力就越多，則處理效果越快［16]；而且當固定化酶處于流體中時，其機械穩定性越好，裝柱運行時更不容易受剪切力而發生形變導致塌柱［17]。此外，固定化酶的溫度及pH性質是影響其工作效率的主要因素，最適溫度越高，能夠為后續加熱解吸脫氨節能，最適pH越高則能較好地適應堿性廢水條件［6]，因此選取最大酶回收率、機械穩定性以及溫度和pH性質這4個實用性指標作為衡量標準。就酶回收率而言，海藻酸鈉（61.47%）與明膠（66.51%）效果基本一致，聚乙烯醇則明顯較低（44.28%），結合制備情況和文獻調研分析其可能原因在于聚乙烯醇水溶液為乳濁液，夾帶了很多氣泡，影響了脲酶凍干粉的分散，另外聚乙烯醇-硼酸反應體系能形成致密的網狀結構，從而阻礙酶和底物間的擴散［16]；機械穩定性上看，固定化材料本身的物理性質是主要的影響因素。此外，由于球體所受壓力比立方體更均勻，更不易發生形變［17]，因此明膠由于其制備方法的差異，造成其機械穩定性（125 g）顯著弱于海藻酸鈉（355 g）和聚乙烯醇（470 g）；溫度和pH性質方面，不同載體對酶的包裹強度不同使得酶的熱運動程度也不同，造成熱穩定性呈現不同效果［18]，而且載體的帶電性能差異也會使其和所固定的酶之間電荷-電荷作用不同，從而影響固定化酶的穩定性［8]。因此，海藻酸鈉、聚乙烯醇及明膠呈現出不同的酶學性質：最適溫度分別為70、70及65℃，最適pH分別為9.5、8.5和8.0。此外，明膠會吸水膨脹，且隨著時間延長會發生膠解現象，造成其穩定性明顯較弱［19]；最重要的是，3種固定化酶在對尿素廢水進行實際處理時，其降解效率由高到低依次為海藻酸鈉、聚乙烯醇和明膠。綜上所述，海藻酸鈉固定化酶展現出較高的酶回收率和不錯的機械穩定性，且其在最適溫度及溫度耐受、最適pH及pH耐受方面性能顯著優于聚乙烯醇、明膠固定化酶及游離脲酶，因此最終選取了海藻酸鈉作為最優的固定化方案，但是關于海藻酸鈉固定化脲酶最優解的證實下一步還可以結合掃描電鏡以及紅外光譜法進行分析，并在今后的研究中逐步深入。

雖然脲酶的固定化可以用共價偶聯法［20-21]、吸附交聯法［22-23]等，但它們大都操作復雜，成本高，不適合工業化生產，而且共價偶聯法會對脲酶造成不可逆的損傷，吸附交聯法固定化酶在流體中容易流失［9]。海藻酸鈉作為一種天然提取物，被證實是良好的包埋法固定化材料。Das等［24]利用3%的海藻酸鈉固定木豆脲酶，使0.12 mg蛋白/mL濃度的酶回收率達到了50%。西瓜脲酶利用3.5%的海藻酸鈉進行固定，最終的固定化率高達72%［25]。利用海藻酸鈉固定化的脲酶最適溫度、pH分別提升了15、1℃，而且固定化酶在25-85℃保持0.5 h或在pH 7-10.5范圍內保持6 h后酶活仍能維持在90%以上，相對于游離酶有顯著的提升，能夠適應尿素廢水堿性環境，而且較高的反應溫度能夠有效節約后續解吸脫氨過程供給的熱能。在其他相關研究中，Srivastava等［14]通過明膠固定化木豆脲酶以制成尿素探測器發現，其最適溫度從47℃提高至65℃，最適pH從7.3變成6.5。通過氨基酸偶合反應，Kutcherlapati等［26]將脲酶制成水凝膠，使其溫度、pH耐受能力得到提高。可以看出，固定化技術能夠提升游離酶的穩定性，甚至改變酶的理化性質，使其在保持酶活的情況下還能適應更高環境條件的要求。然而，值得注意的是當前的固定化技術結果大都集中在提升了酶的最適溫度及溫度耐受性［8，27-28]，但是酶的最適pH或pH耐受性往往得不到較大的改善，甚至由于固定化基質材料的不同，反而使最適pH向相反的方向移動［29-30]，因此用于尿素廢水處理還是離不開添加磷酸或通入CO2以調節廢水條件。但本實驗基于耐堿脲酶，在固定化后使得其pH穩定性進一步提高，因此能夠直接進行尿素廢水處理，實用性更強。

用φ 2 cm×20 cm的柱子填料運轉，在70℃時處理的尿素廢水流量能達到19 mL/min，且初始尿素降解率為90.25%，降低流速能進一步提高尿素降解率，據此可以根據生產流量要求設計柱子結構以及床層尺寸，如將多根固定化柱并聯或者改用更大孔徑的柱子能夠快速高通量地處理尿素廢水。該裝置連續運轉35 d，殘余酶活以及尿素降解率均能保持穩定在90%以上，半衰期能夠維持兩個月以上，使用期限可達55 d，效率可靠，只需定期更換填料柱即可。因此，利用該海藻酸鈉-CaCl2固定化脲酶裝置處理工業尿素廢水是切實可行的，且經后續改進，如通過組合固定化技術或者運用新型固定化方法、開發新的固定化材料，能夠使固定化酶性質進一步提高，從而實現尿素廢水的綠色高效處理。此外，本固定化酶處理技術主要消耗材料如脲酶發酵培養基以及用于固定化的海藻酸鈉和氯化鈣等廉價易得，且固定化酶大規模生產時成本還可以進一步減少，從而降低尿素廢水處理費用，為中小型生產企業的尿素廢水處理工藝提供選擇。

4 結論

經固定化處理后，海洋堿性脲酶最適溫度、最適pH、耐熱性及耐堿性皆得到提升。與聚乙烯醇和明膠相比，海藻酸鈉固定化方案綜合效果最佳。利用海藻酸鈉固定的海洋脲酶進行尿素廢水處理簡單易行、價格低廉，φ 2 cm×20 cm柱處理速度為19 mL/min，有效期達55 d，是除化學處理法外的一條有效途徑。