低成本合成聚羥基脂肪酸酯（PHAs）的研究進展

邱石正 李佳益 楊景辰 劉長莉

（東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040）

聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）是一種由微生物合成的天然生物聚酯，在不利的生長條件下作為碳源和能量存儲、氧化還原調節(jié)劑和冷凍保護劑維持細胞生存［1]。同時，由于其生物可降解性、生物相容性、熱塑性等優(yōu)良特性，PHA已經廣泛地應用于諸多領域。雖然PHA的使用能夠有效地避免石化塑料對環(huán)境造成的危害，但這種環(huán)境友好的生物塑料成本過于高昂，限制了其未來發(fā)展的更多可能。目前，PHA的商業(yè)生產價格高達每千克2.2-5.0歐元，而聚丙烯塑料的價格僅為每千克1.0歐元［2]。微生物工業(yè)制品的生產成本主要取決于原料的價格、連續(xù)發(fā)酵過程的滅菌成本以及產品的產量與產率，為了使工業(yè)生物技術與化學工業(yè)具有相同的競爭力，開發(fā)低成本的生物加工技術具有重要意義。本文針對目前PHA生產面對的諸多問題，結合課題組的一些研究成果和國內外最新的研究進展，綜合闡述低成本合成PHA的可行方法，并對今后PHA的研究前景加以展望。

PHA是具有多種化學結構的脂肪族生物聚酯的統(tǒng)稱，其分子結構通式如圖1所示。

圖1 PHA的分子結構

式中，m為主鏈單體鏈長，多為1-3；n表示聚合度，決定了分子量的大小；R為側鏈，可以是多種烷基基團。根據(jù)PHA單體的碳原子數(shù)，通常將其分為兩類：單體含3-5個碳原子的為短鏈PHA（SCL-PHA），廣泛分布于古細菌以及革蘭氏陽性和陰性細菌中［3-4]，一般具有較高的結晶度和耐熱性；單體含6個及以上碳原子的為中長鏈PHA（MCL-PHA），大多存在于假單胞菌Pseudomonas中［5]，結晶度較低，具有良好的彈性。然而天然PHA的性能很難滿足人類的需要，所以通常會采用物理共聚的方式引入其他生產生活中需要的材料性能。例如，聚-3-羥基丁酸（PHB）是PHA均聚物的常見形式，其力學性能與傳統(tǒng)熱塑性塑料聚丙烯相似，但抗沖擊性較差，很容易折斷，且加熱溫度高于熔點10℃左右時就會降解，限制了它的應用范圍。于是人們向PHB單體中加入少量MCL-PHA單體，大幅提高其韌性和彈性而不會過多地降低其熔點，得到聚羥基丁酸羥基己酸酯（PHBHHx）等一系列性能優(yōu)異的PHA共聚物。表1展示了不同種類PHA與塑料的物理性能對比。

1 PHA的分類及特性

表1 不同種類的PHA與塑料的物理性質的比較

2 PHA的應用現(xiàn)狀

2.1 醫(yī)藥領域的應用

PHA不僅與人體組織細胞相容性良好，而且降解的產物都是機體本身具有的物質，目前已經應用于靶向藥物釋放的載體、外科手術器材和植入性組織材料等［6]。藥物運輸方面，天然PHA是惰性的，不具備靶向能力，需要人為地物理共聚或化學修飾改變其特性［7]。這樣，藥物就可以包埋在載體中或吸附在其表面，并在表面耦聯(lián)了特異性靶向分子的納米顆粒，以此來控制靶向藥物與細胞表面受體的識別和結合，避免了傳統(tǒng)材料可能的致癌風險［8]。不僅如此，外科手術使用的醫(yī)用縫合線也可以由PHA材料制作。理想的手術縫合線需要具有彈性、表面光滑、可抵抗細菌生長并與組織細胞相容，3-羥基丁酸-3羥基己酸共聚物［P（3HB-co-3HHx）]等材料完全符合人們的預期［9]。而PHA材料制作的三維支架則為廣大的先天心臟瓣膜病患者帶來了福音，同時植入性的組織工程材料也在神經導管、消化道、心血管及軟骨疾病等方面發(fā)揮了開創(chuàng)性作用［10]。PHA三維支架可以支持細胞在損傷部位生長，幫助其形成特定的組織，等到受損組織修復后再自行降解，幾乎不會產生免疫排斥反應［11-12]。

2.2 工業(yè)、農業(yè)領域的應用

PHA在工業(yè)領域擁有巨大的應用潛力，先后有四代PHA產品陸續(xù)投入生產（PHB、PHBV、PHBHHx 和 P3HB4HB），產品主要包括包裝塑料、器具材料、服裝材料、噴涂材料和纖維等［13]。為了進一步提高PHA的機械性能和熱性能，通常與納米材料或其他生物塑料如聚乳酸（Polylactide，polylactic acid，PLA）共聚。與生物基塑料相比，傳統(tǒng)包裝塑料在地表土壤的降解周期約為1-2個世紀，而PHA生產出的農田地膜可以在富含微生物的土壤環(huán)境中被迅速降解，具有較高的生態(tài)和經濟優(yōu)勢。不僅如此，PHA在水產養(yǎng)殖業(yè)也發(fā)揮著重要作用：Thai等［13]通過投放高PHB濃度的飼料喂養(yǎng)羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii發(fā)現(xiàn)，PHB可以改善甲殼類水生動物的腸道菌群，抑制細菌性病原體從而提高幼蟲的存活率［14]。

3 PHA的低成本合成

PHA的商品化發(fā)展一直受制于其高昂的生產成本，從PHB、PHBV、PHBHHx 到 P3HB4HB，研究者在提升PHA材料學性能的同時一直在為降低成本而努力。如果解決底物成本與滅菌成本過高、產率和性能較低的問題，PHA完全有希望取代塑料。筆者認為，降低PHA成本有兩種途經：一是從PHA生產的各個環(huán)節(jié)分別找到低成本的方法；二是大幅提高PHA的產量，也就間接降低了PHA的單位生產成本。

3.1 低成本合成途徑的構建

代謝途徑的構建很大程度上依賴于不同菌種對不同碳源的利用能力。簡單來說，生產PHA的微生物更傾向于利用與PHA單體結構相似或相關的碳源，這也就決定了除PHB以外，糖類為唯一碳源時很難天然合成其他類型的PHA。如果想要生產性能更加優(yōu)異的PHA共聚物，就不得不在生產過程中添加昂貴的第二種碳源。因此，通過重新構建微生物的PHA合成途徑，使糖類作為唯一碳源成為可能。

PHBV是一種已經廣泛應用的第二代生物塑料產品，但成本仍然受制于不得不補充相關碳源（丙酸、戊酸等）來生產3HV單體的前體丙酰輔酶A。為解決這一問題，Srirangan等［15]在大腸桿菌中構建了不相關碳源（如葡萄糖、甘油等）直接合成P（3HB-co-3HV）的途徑，創(chuàng)新地利用睡美人變位酶操縱子（Sleeping beauty mutase，SBM）激活編碼誘導琥珀酰輔酶A轉化為丙酰輔酶A前體的酶；而Wang等［16]開發(fā)了利用無關碳源生產PHBV的蘇氨酸合成途徑，過表達thrABC操縱子與蘇氨酸脫氫酶基因，甚至設計了檸檬酸途徑與蘇氨酸合成途徑的結合，均只使用葡萄糖為唯一碳源，最高使PHBV共聚物中的3HV單體部分含量提高到25.4 mol%。目前，幾乎所有的高性能PHA共聚物都實現(xiàn)了唯一碳源的廉價生產。

3.2 對菌種的改造

通過基因工程技術，對細菌進行基因編輯，不僅可以大幅提高PHA的產量，還可能擁有其他多方面的優(yōu)勢，如提高微生物的抗逆性、增大菌體承載的PHA體積等。Tao等［17]通過CRISPRi技術抑制了編碼嗜鹽菌Halomonas speciesTD01分裂時ftsZ基因的表達，導致細胞形態(tài)的延長。與對照組相比，細胞長度增加了20-70倍，大大增加了胞內PHA的積累空間。為了進一步節(jié)約細菌在運動上的消耗，Wang等［18]敲除了76個惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaKT2442的關于鞭毛和菌毛合成及組裝的基因，得到的重組細菌顯示出諸多生理上的優(yōu)勢，如提高了細菌對氧化應激的耐受性、增強了PHA的積累能力等［19]。此外，為了解決部分細菌能夠表達異源基因的啟動子較少的問題，Shen等［20]研究出一種基于Pporin構建啟動子庫的方法，在啟動子核心區(qū)進行飽和突變，顯著增加了啟動子文庫的多樣性，適用于多種不同異源基因的轉錄。于是在嗜鹽菌H.bluephagenesisTDH4中構建了含編碼4HB-CoA轉移酶的orfZ基因，由文庫中選擇的啟動子驅動，經50 h生長后，PHA占細胞干重80%以上，產率為1.59 g/L/h。

所以選擇優(yōu)質高產底盤菌進行基因編輯是一個提高產量的可行辦法，可以彌補其在其他方面的不足。例如，大腸桿菌既不能合成也不能降解PHA，但由于其基因序列背景清晰、培養(yǎng)與操作簡單、體內又無可以使PHA降解的酶，成為實施基因改造的熱門底盤菌。研究者通常將其他高產菌種的關鍵操縱子如phaCAB等轉入大腸桿菌中，再調節(jié)其生理狀態(tài)和代謝流，綜合提高PHA產量。表2展示了部分高產工程菌的類型和產量。

表2 部分高產工程菌的改造基因及其產率

3.3 底物成本

為微生物發(fā)酵提供了營養(yǎng)的底物約占生產總成本的50%［24]，這就意味著精致的糖類和脂肪酸需要被廉價的底物所替換。碳源的選擇標準應該是更加經濟、可行和高效的，一些工業(yè)、農業(yè)生產的廢棄物是比較理想的選擇。

3.3.1 粗甘油 生物柴油的副產物——粗甘油越來越受到研究者們的青睞。僅以2015年為例，全球生物柴油的年產量就達2.91×107t。作為其主要衍生物，80%純度的粗甘油的價格僅為每噸44美元［25]。據(jù)此，Pan等［26]將粗甘油預處理后使用兩步法合成高附加值的1，3-丙二醇和PHA。第一步，厭氧發(fā)酵合成1，3-丙二醇；第二步，利用碳化棒狀桿菌Corynebacterium HydrocarbooxydansATCC 21767和大型芽孢桿菌Bacillus MegateriumDSM 90的混合菌群將厭氧發(fā)酵的副產物羧酸和剩余的甘油轉化為PHB。不過，粗甘油的預處理略微增加了成本。Mo?ejko-Ciesielska等［27]從活性污泥中篩選出一株氣單胞菌Aeromonasspp.，在48 h內細胞于純甘油或粗甘油上的增加的細胞干重相同，所以無需提純甘油，大大節(jié)約了成本。而Volova等［28]在2018年的報道中已經將甘油為底物的P（3HB）產量提高至85.8 g/L，但仍略低于糖類。

3.3.2 活性污泥 活性污泥是用于污水處理的微生物群落及其依附的有機質和無機質的總稱，因其中含有大量的營養(yǎng)物質被認為是合成PHA的理想底物。例如，棕櫚油是世界上生產量和消費量最大的可食用植物油，每年棕櫚油廠廢水中大量的低質量棕櫚油污泥（Sludge palm oil，SPO）有待再利用［29]。SPO的主要成分為長鏈脂肪酸，非常適合用來制備 mcl-PHA［30]。Kang等［31]篩選出惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaS12以SPO為唯一碳源分批補料發(fā)酵，提取出3.7 g/L的PHA，產率約為41%。Ward等［32]更是證明了假單胞菌Pseudomonas利用SPO與利用脂肪酸生產PHA的產率是相似的，避免了使用精致碳源，大大降低了底物成本。

3.3.3 木質纖維素 工業(yè)木材殘渣、農業(yè)廢料等廉價的木質纖維素材料長期得不到有效利用，是合成PHA的潛在碳源。但對于大多數(shù)天然纖維素材料來說，結構的致密性和異質性阻礙了酶解的發(fā)生，使得預處理尤為重要。其中木質素是一種廣泛存在于植物體中的含氧代苯丙醇的高聚物，需要被解聚和脫氧為單體，才可以被微生物代謝和利用。Kumar等［33]馴化了一株羅氏真養(yǎng)菌R. eutropha，能夠耐受水解產物中的苯甲酸鹽、苯酚和糠醛等抑制劑，通過協(xié)同代謝合成PHA，產量為11.1 g/L。而價格更低、水解條件更溫和的纖維素和半纖維素更適合作為碳源。以小麥秸稈為例，僅歐洲地區(qū)就年產近1×108t，采用蒸汽爆破或稀硫酸處理得到的水解產物主要為葡萄糖、木糖和阿拉伯糖［34]。Cesário等［35]在 2 L攪拌槽反應器中分批補料發(fā)酵61 h后達到P（3HB）濃度的最大值105 g/L，是迄今為止在農業(yè)廢棄物方面所達到的最高水平。

3.4 發(fā)酵工藝流程的改進

如何使微生物保持在發(fā)酵的最佳條件是PHA工業(yè)化生產的困難之一：若PHA積累過早發(fā)生，則會降低產率；若PHA積累過慢，則可能將碳源浪費在細菌生長上。為進一步提高其成本競爭力，研究者改進了發(fā)酵方式和流程，開發(fā)了同時積累多種產品的新途徑。

3.4.1 聯(lián)合生產 在不影響細胞代謝平衡的條件下，能夠在合成PHA的同時積累多種其他產品具有極高的經濟價值。氨基酸、蛋白質、醇、胞外聚合物等產品都可以與PHA聯(lián)合生產［36]。以其中一種具有高附加值的小分子L-色氨酸為例：L-色氨酸是一種人體必需氨基酸，可以治療糙皮病、營養(yǎng)缺陷和用來誘導睡眠等。研究發(fā)現(xiàn)，PHB的生物合成可以改變細胞的代謝流和氧化還原狀態(tài)，提高L-色氨酸的產量。Gu等［37-38]通過在工程大腸桿菌GPT1020中表達含phaCAB操縱子基因的合成途徑來增強L-色氨酸的產生，得到14.4 g/L的色氨酸和9.7%的PHB（W/W）。聯(lián)合生產的優(yōu)勢在于可以最大限度地利用底物和細胞的代謝能力，卻也受到微生物遺傳特性和代謝能力的限制。如果可以進一步優(yōu)化共生產的參數(shù)、提高上述高經濟價值產品的收率，這種一舉多得的聯(lián)合生產方式將有望取代單一產品的傳統(tǒng)發(fā)酵模式，成為PHA低成本生產的有力途徑［39]。

3.4.2 分批補料和連續(xù)發(fā)酵 分批補料發(fā)酵可以解除產物對發(fā)酵的抑制，減少消耗在菌體生長上的成本。據(jù)有關研究顯示，生產PHA的最佳碳氮比為32-45，所以 Norhafini等［40]通過開始添加所有營養(yǎng)使菌體快速生長、隨后補加碳源限制氮源保持最佳碳氮比直到發(fā)酵結束，達到了大于50 g/L的聚合物積累量。與之相比，連續(xù)發(fā)酵會在添加底物的同時以相同速度流出產物，可以使細胞始終維持在最佳生產狀態(tài)。但是連續(xù)發(fā)酵高昂的成本并不符合我們的初衷：對底物利用率較低帶來的浪費、連續(xù)滅菌和自動化設備的成本都是目前難以解決的問題。

3.4.3 藍水生物技術 為解決上述發(fā)酵過程中高昂的成本問題，Yin和陳國強等［41]開發(fā)出一種基于嗜鹽菌和海水的藍水生物技術，或是低成本連續(xù)發(fā)酵的成功嘗試。嗜鹽菌是一類生活在高鹽濃度環(huán)境下的微生物，其中嗜鹽單胞菌HalomonasTD01、Halomonas campaniensisLS21和嗜鹽古菌地中海富鹽菌Haloferax mediterranei等均已成功地應用于PHA生產中。他們利用一些嗜鹽菌可以在高鹽高堿的條件下生長而其他微生物會受到抑制的特性，實現(xiàn)了開放式不滅菌的連續(xù)發(fā)酵：一方面避免了滅菌過程中帶來的諸多額外成本；另一方面使用海水作為高鹽濃度的培養(yǎng)基節(jié)約了寶貴的淡水資源。如果以嗜鹽菌為底盤菌進行基因改造，進一步降低底物成本，有望彌補其為數(shù)不多的劣勢，為PHA工業(yè)化生產帶來重大變革。

值得注意的是，藍藻Cyanobacteria以及海洋光合紫細菌Rhodovulum sulfidophilum等自養(yǎng)微生物均可以在海水中合成PHA，同樣具備藍水生物技術的諸多優(yōu)勢［42-43]。藍藻等光營養(yǎng)細菌可以從陽光中吸收能量，以CO2和乙酸鹽為底物的成本非常低廉。雖然藍藻的生產力非常低下，但這項研究無疑具有著重大意義，異養(yǎng)微生物產生PHB的成本約為2-5歐元/kg而藍藻在含有高碳、氮和磷的廢水中培養(yǎng)并通入工業(yè)煙氣中的二氧化碳，可以使成本降低到2 歐元 /kg［44]。

3.5 PHA產業(yè)化現(xiàn)狀及低成本化的預期效果

不可否認的是，到目前為止，采用微生物發(fā)酵技術生產的生物塑料對于化工生產來說仍然不具備價格的優(yōu)勢。利用天然羅氏真養(yǎng)桿菌Ralstonia eutrophus生產PHA的價格高達16美元/kg，比聚苯乙烯塑料高出18倍［45]。通過工程大腸桿菌生產PHA可以將成本控制在4美元/kg左右，但仍需進一步降低。成本控制進入瓶頸的原因很大程度上與高昂的底物成本有關，糖類為底物生產PHA的轉化率最高僅為48%，再加上其他成本，PHA的售價將達到底物成本的10倍以上。根據(jù)已經投產的公司數(shù)據(jù)來看，德國BASF公司和美國Cargill Dow公司傾向于使用淀粉為底物生產PHA。由于淀粉的價格（0.22美元/kg）低于葡萄糖的價格（0.49美元/kg），對于每年1×105t PHB的生產規(guī)模，成本將從4.91美元/kg降至3.72美元/kg［46]。隨著PHA共聚物的投產，PHB受到很大沖擊，Metabolix公司曾實現(xiàn)了60 t的PHB大規(guī)模發(fā)酵，使成本控制在2.2美元/kg，但最終仍不得不退出生物塑料領域。雖然PHA共聚物成本是聚乙烯的2-5倍，但性能遠優(yōu)于PHB甚至聚烯烴塑料，可以應用于生物醫(yī)學等高附加值領域。近年來，通過現(xiàn)代微生物工業(yè)技術將合成生物學和基因編輯技術整合起來，對PHA的合成途徑重新構建，加之藍水生物技術的興起，PHA對于石化塑料不再保持價格上的劣勢不再是夢想。表3展示了各種底物在最優(yōu)利用下的產品價格，不過由于當時的貨幣價值與現(xiàn)在不同，不能簡單加以比較。另外，雖然一些工農業(yè)廢棄物價格較低，但較低的單位產率可能會造成PHA提取和下游加工的困難。

表3 不同底物生產PHA的經濟性評價［46]

4 結語

從PHA的發(fā)展史來看，PHB等天然PHA的生產歷史已達數(shù)十年之久，具有較為成熟的產業(yè)鏈。但由于其高昂的成本和特殊性能的限制，PHB的前景并不被看好。PHBV作為對PHB的改進，在添加了3HV單體后彈性有很大提高。而如今已經廣泛使用的PHBHHx是新型的短鏈和中長鏈PHA共聚物，與PHBV相比，具有更低的結晶度和更高的延展性，性能可以與聚乙烯塑料媲美，也能夠以脂肪酸為唯一碳源生產，只是價格對聚乙烯不具備競爭力。

隨著基因工程技術和合成生物學的不斷發(fā)展，通過人為改變菌株的代謝途徑和形態(tài)結構，利用廉價的底物或工農業(yè)廢棄物，開發(fā)更為有效的生產工藝流程，使PHA的低成本合成成為可能。根據(jù)歐洲生物塑料協(xié)會（European Bioplastics）預測，全球生物塑料年產量將從2017年的2.05×106t增長至2022年的2.44×106t。據(jù)此，隨著PHA生產成本的逐步降低，PHA取代部分傳統(tǒng)石化塑料的趨勢已不可逆轉。筆者認為，今后PHA產品的開發(fā)可能會傾向于短鏈與幾種不同中長鏈單體（HV、HHx、HD和HO等）的結合，形成三聚物甚至四聚物，隨著調整引入中長鏈單體的種類、數(shù)量和比例等，結晶度、熔融溫度和機械性能會隨之改變，就可以根據(jù)人類需求來“制造”相應的PHA。但值得注意的是，在根據(jù)需要構建代謝途徑時，還應從整個代謝網絡角度分析PHA合成是否會影響其他重要的代謝途徑，盲目地基因編輯或改造代謝途徑手段并不可取。