施肥影響土壤性狀和微生物組的研究進展

劉紀愛 束愛萍 劉光榮 李祖章 劉增兵 高崢

（1. 江西省農業科學院土壤肥料與資源環境研究所 國家紅壤改良工程技術研究中心，南昌 330200；2. 山東農業大學生命科學學院 作物國家重點實驗室，泰安 271000）

施肥是提高土壤肥力和作物產量的有效途徑。通過大量施加肥料以達到糧食高產的效果是目前我國農業生產常用手段，但不斷增加的化肥施用量和過高的化肥施用強度給環境帶來了巨大的壓力，導致嚴重的土壤退化和環境污染［1]。自20世紀80年代以來中國一直在大力推薦有機肥的應用，有機肥可通過改變土壤物理性狀、養分、酶活性及微生物組群落結構，來降低或消除因長期單施或過施無機肥對土壤理化性狀和微生物生態產生的負面影響，被認為是增加土壤有機質和提高土壤肥力的有效途徑［2-3]。目前的研究表明，無機和有機肥料的組合比單獨的無機或有機肥料更促進可持續的作物生產、提高谷物產量［4-5]。尤其在測土配方施肥行動及到2020年化肥使用量零增長行動的大背景下，有機無機配施將是我國今后肥料施用發展的必然趨勢。

微生物組在土壤生態系統中起著舉足輕重的作用，影響著大量至關重要的生態系統過程，包括土壤能量流動和元素循環、土壤有機質的礦化分解及一些作物生長必需營養的供給，其生物量、多樣性和活動是陸地生態系統土壤質量、生產力和可持續性的敏感指標［6-8]。微生物組包括微生物（細菌、古細菌、低等或高等真核生物和病毒）及其基因組（基因），以及其周圍環境在內的全部，包括環境中的所有生物和微生物因素［9]。土地利用類型、季節、植被、長期或短期施肥處理均會對細菌、真菌、古菌等不同種類微生物的豐度、多樣性及群落結構產生不同影響，通常來講，施用有機肥處理土壤細菌的豐富度和多樣性指數高于施用無機肥處理，并且不同施肥處理間細菌群落結構也存在差異［8，10-11]。土壤微生物組對不同施肥處理的響應和變化可以通過傳統的微生物檢測手段及現代的擴增子高通量測序和宏組學技術進行揭示。

1 土壤微生物組的研究方法

而快捷檢測土壤中微生物群落生物量和結構的方法，但磷脂脂肪酸不能表征特定的微生物群落，無法給予系統發育信息［13]。克隆文庫的構建可以獲取不同微生物的系統發育信息，但因其操作流程繁冗、工作量大、測序深度及覆蓋度較低，逐步被取代。

擴增子高通量測序和宏組學技術憑借其數據量大、避開培養過程、囊括信息全面等優點為土壤微生物組的研究揭開了新篇章。16S rRNA基因的高通量測序和系統發育分析為微生物群落的現代研究奠定了基礎［14]。包括宏基因組學、宏轉錄組學、宏蛋白組學、宏代謝組學在內的宏組學技術分別在DNA、RNA、蛋白質、代謝水平上來反映土壤微生物組成及群落結構，不同水平上的測序手段存在其各自的利弊，詳細信息見表1。珂博和張彤團隊在近期聯合多維宏組學（宏基因組、宏轉錄組及目標性代謝組學）解析了混合微生物群落內細菌間協同代謝關系［15]。除此之外，高通量基因芯片GeoChip也用于分析微生物群落的功能多樣性、組成、結構、代謝潛力/活性和動態［16]。

土壤微生物組的揭示依賴于有效而恰當的微生物檢測手段和研究方法。傳統的土壤微生物研究方法包括微生物純培養技術、磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acids，PLFA），以及基于核酸分子的克隆文庫等方法。土壤中大約有107種細菌物種，通過純培養的手段僅能夠檢測到其中的1%-10%，難以全面揭示微生物的組成［12]。磷脂脂肪酸分析是一種靈敏

2 施肥對土壤性狀的影響

2.1 施肥對土壤物理性狀的影響

表1 土壤微生物組研究方法的特征對比

土壤質量是土壤物理、化學和生物學性狀的綜合表現，良好的土壤條件可以為作物生長提供良好的生態環境。無機肥的施加對土壤團聚性、土壤容重并不會產生負面影響［20-21]。適當施加有機肥可以降低土壤容重、提高土壤的孔隙度、提高土壤大團聚體含量，促進良好土壤物理結構的形成，改善土壤質量，有利于農作物生長［22-23]。Sihi等［24]發現，長期施加有機肥的印度北部水稻土壤容重指標較常規NPK施肥處理土壤容重低。Williams等［25]的研究中，有機耕作土壤的土壤團聚體平均重量直徑和孔隙度增加，具有更強的吸水能力和更低的密實度。Chaudhary和Suja等［20，26]也報道了類似的結果。

2.2 施肥對土壤養分的影響

施肥是維持土壤肥力的重要管理措施，其最直接的作用是改變土壤的理化指標和養分含量。短期施加無機肥可以顯著影響退化羊草草原土壤速效氮、速效鉀等速效養分的含量，但對土壤全氮、有機質等指標沒有明顯的改變［27]。Bei等［28]在對華北平原石灰性土壤的研究中指出，有機肥替代的短期施加不僅會顯著影響土壤速效氮、速效鉀含量，也會顯著提高土壤有機質和全氮含量。長期NPK的施加會顯著提高土壤含水量、可獲得性磷、陽離子交換量等指標，而長期有機肥處理對土壤有機碳、總氮、可獲得性磷、可獲得性鉀含量等指標的影響更顯著［29-31]。需要特別注意的是，越來越多的研究證明，長期施加無機肥會導致土壤pH降低，引起土壤酸化，有機肥替代可以提高深層土壤的肥效和耐酸性，減緩因單獨施加無機肥產生的土壤酸化趨勢［32-35]。

2.3 施肥對土壤酶活性的影響

土壤酶活性也是土壤質量的指標之一，是土壤系統生化功能的關鍵組成部分［36]。土壤酶活性能夠直接敏感地響應施肥處理和土壤環境的變化，與施加無機肥相比，有機肥的添加可以提高土壤脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶、酸和堿性磷酸酶活性等土壤酶活性［37-39]。沈冰濤等［40]研究有機肥替代無機肥對小麥產量及土壤養分和酶活性的影響發現，適當比例有機肥替代無機肥處理既能保證作物產量，又能一定程度的提高土壤肥力和酶活性（過氧化氫酶、蔗糖酶和磷酸酶活性）。Wu等［41]指出施用有機肥和有機-無機肥可顯著提高丘陵果園地區土壤過氧化氫酶、蔗糖酶、脲酶和酸性磷酸酶的活性。

3 施肥對土壤微生物組的影響

3.1 施肥對土壤微生物豐度和多樣性的影響

除了土壤理化和酶活性指標，土壤微生物也可以對土壤環境的改變做出快速響應。土壤細菌對于維持土壤肥力和土壤生態系統功能至關重要，并且通常對肥料投入敏感［42]。Hu等［43]使用基于16S rRNA基因的定量PCR（qPCR）方法估算長期不同施肥處理的細菌豐度，結果顯示NPK處理和未施肥對照之間沒有顯著差異，有機肥的替代或單純有機肥的施加均使細菌豐度比對照顯著提高。Sun等［32]的研究中也得到了類似的結果，并且他們指出NPK加牲畜糞便的細菌豐度比NPK加小麥秸稈高得多。關于細菌多樣性對施肥處理的響應，許多研究都得到了一致的結論：長期NPK施肥會導致土壤細菌豐富度和多樣性降低，有機肥替代或者單獨有機肥處理的細菌豐富度和多樣性升高，甚至顯著高于NPK處理及不施肥對照［43-46]。值得一提的是，無機肥導致細菌豐度和多樣性降低的趨勢在短期施肥中就可以被發現［47]。

土壤中的細菌和真菌通常占土壤微生物總量的90%以上，它們是土壤有機質分解和養分動態的主要調節劑［48]。Bei等和 Guo 等［28，47]的研究均顯示，短期無機肥和有機肥處理之間，真菌ITS基因拷貝沒有顯著差異。長期NPK處理也會導致土壤真菌多樣性指標均顯著下降，有機肥的添加使真菌豐富度和多樣性提高［49-51]。Wang等［52]的研究中也提出不同的施肥方式改變了真菌類群的豐度，并按其營養策略分組，與礦物肥料處理相比，土壤有機輸入增加了土壤真菌α-多樣性。

一些古菌，特別是氨氧化古菌（Ammoniaoxidizing archaea，AOA）也會對不同施肥方式作出響應，但其對施肥處理敏感性低于氨氧化細菌（Ammonia-oxidizing bacteria，AOB），即使AOA的數量比AOB高數百倍［53-54]。不同無機肥、有機肥短期處理下，AOA的豐度和多樣性無顯著差異［55-56]。長期無機肥或有機肥處理對AOA的豐度的影響較小，并且無機肥和有機肥的聯用并不會引起AOA豐富度和α多樣性顯著變化［57-58]。原生生物是施用氮肥最易感的微生物組分，氮肥通過改變不同的非生物特性和細菌和真菌群落間接地減少了原生生物的多樣性［59]。有機肥處理會使土壤形成根本不同的原生生物群落結構，并且增強最豐富的原生生物分類群的相對豐度，進而使得整體多樣性降低［60-61]。

3.2 施肥對土壤微生物群落結構的影響

不同施肥措施和施肥周期對土壤微生物群落結構的影響程度存在一定差異，這種影響差異除了土壤因素外，還受到植物類型的影響［62-63]。不同無機和有機長期處理的土壤中的細菌群落組成彼此分開，表現出微生物群落結構的顯著差異，而短期施肥處理則對微生物群落產生輕微的影響［28-29，46]。目前無機和有機肥料的研究中，各類土壤樣本中主要的細菌門包括：Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria等，并且它們相對豐度的總和占細菌群落的 70%以上［2，8，45]。Ramirez等［42]在N富集對北美生態系統微生物活動和群落組成變化的研究中發現，N添加使Actinobacteria和Firmicutes的相對豐度分別增加，同時減少了Acidobacteria、Verrucomicrobia、Cyanobacteria、Planctomycetes和Deltaproteobacteria等5個門的豐度。Cui等［45]的研究表明NPK肥料的長期施用顯著增加了紅壤性水稻土壤的Nitrospirae的豐度，而糞肥增加了Proteobacteria、Chloroflexi和Firmicutes的豐度，但在糞肥和化學NPK聯合施用的處理中檢測到最豐富的Actinobacteria和Planctomycetes。此外，有機肥的施加可以顯著富集細菌微生物組成中的Firmicutes。Kumar等［46]在水稻土中連續施用無機和有機肥料47年，發現有機肥和無機肥配施處理的Firmicutes的OTU比例明顯高于無機肥處理。Tu等［64]在7年、9年和10年的人工林中均發現，有機肥增加了Firmicutes的比例，而對照和無機肥料處理中沒有此效果，并且他們也提出芽孢桿菌是最豐富的Firmicutes類，可能代表對有機肥施肥反應最明顯的細菌類型，可作為提高土壤肥力和實現可持續發展的高效細菌。

同細菌群落一樣，土壤真菌群落組成在無機和有機施肥方式之間可以明顯分開，但其對土壤養分狀況變化的敏感度低于細菌［8，65]。多數研究中，Ascomycota門在真菌群落中占主導地位，占總序列的60%以上［2，8，65]。與不施肥處理相比，有機肥的應用能夠顯著增加增加主導真菌Ascomycota的相對豐度，但在無機肥處理下其豐度降低［50-51，66]。除此之外，NPK應用顯著增加了已知致病性狀的真菌類群的豐度，如Chaetothyriales目，Chaetothyriaceae和Pleosporaceae科，以及Corynespora、Bipolaris和Cyphellophora種；相反，在有機肥施加的處理中則抑制了可能的致病性真菌生長，并增加真菌的生物多樣性，從而提高土壤和作物的健康狀況［49，51，67-68]。AOA和AOB對不同施肥處理的響應也有差異，與NPK相比，有機肥的應用增加了AOB豐度，但降低了AOA豐度［55，69]。有機肥能夠強烈改變原核生物的組成，提高原核多樣性，改善長期施肥下原核生物的群落結構［34，70]。

3.3 施肥條件下土壤性質和土壤微生物的耦合

土壤微生物群落的生長、活動和功能多樣性受到各種土壤理化的影響，包括土壤pH、總氮（TN）、有機碳（SOC）含量及土壤酶活性。在施肥條件下，pH是改變細菌、真菌、古菌及原生生物等微生物落群落的主要驅動因素，TN、SOC、酶活性等因素也是不同種類微生物群落組成的重要貢獻者［2，53，71-72]。無機肥長期施加下，細菌多樣性在中性土壤中最高，在酸性土壤中較低，并且在pH低于5的土壤中，細菌群落組成的差異最為明顯［73]。Ma等［51]在探究中國黑土地上真菌群落組成對長期化學和有機肥施用的響應時發現，土壤有機質和pH值是真菌群落組成的兩個最重要的貢獻者。Zhang等［74]的研究中，隨著不同施肥處理土壤pH的降低，AOA與AOB豐度的比例大大增加，表明紅壤水稻土的pH值是影響AOA和AOB豐度和群落結構的重要因素。施用氮磷鉀肥加豬糞可以提高土壤pH值，改善土壤有機碳含量和聚集，提高原核多樣性，改善27年施肥后原核生物的群落結構［34]。不同施肥處理引起的碳、氮水平改變，影響土壤微生物的群落結構和多樣性。Zhang等［75]在短期N添加后，人工林土壤SOC、TN和總磷（TP）的含量和元素比率發生了變化，進而引起微生物群落分布受到N添加的限制。Wang等［76]對中國東北黑土長期施肥的研究中指出，土壤NH4+、TN和TC分別解釋了不同有機無機肥處理間21%、19%和18%的尿素分解微生物豐富變化，并且他們也提出糞肥應用是尿素分解微生物群落的主要驅動力。與此同時，微生物自身活動會改變土壤團粒的直徑和結構，進而改變土壤物理性狀；另一方面，微生物會參與土壤有機質和礦物質的分解，參與土壤中碳、氮、磷等多種元素的循環，改變土壤化學特征［77]。在微生物協助下，有機肥的分解歷程中會產生包含有多種酸性功能團的腐殖酸，是一類弱酸，其憑借酸基和胺基質子化來增強土壤的酸堿緩沖能力，緩解因單純施加無機肥引起的土壤酸化問題［78]。因此施肥條件下土壤理化性質與微生物兩者絕不是割裂開的，兩者相互耦合，相輔相成，共同促進作物和植物的生長。

4 不足和展望

雖然前人關于不同施肥處理對土壤理化性質、酶活性以及微生物群落結構的影響進行了大量的研究，但是在新方法的采用、稀有微生物的研究、微生物組的綜合分析及微生物功能的探究等方面仍然缺少深入的闡述，亟待開展相關的研究。

4.1 新方法的采用與多組學融合

除上文中提到的微生物檢測方法，單細胞測序技術、第三代測序技術等新方法也應該引入土壤微生物組的研究。任何一種單獨檢測手段都有其優缺點，因此以后的研究需要將多種檢測方法結合（如培養與測序結合、多種組學的聯合使用），優勢互助，消除單一技術的弊端，才能更加全面地了解不同施肥方式對微生物組的影響，并且隨著測序等檢測技術以及生物信息學的發展，檢測成本會逐步降低，數據庫會越來越完善。

4.2 稀有微生物的研究

稀有物種代表了大量的遺傳多樣性，并且在生態系統中發揮重要的關鍵生態功能［79]。目前土壤微生物的相關研究大多集中于相對豐度較高的優勢微生物，但稀有微生物的種類遠多于優勢微生物，能夠對土壤環境的變化和施肥處理做出敏感的響應，因此確定稀有微生物在不同施肥處理下的波動、了解調控稀有微生物的因素至關重要。

4.3 微生物組的綜合分析

土壤微生物對土壤肥力至關重要，目前大多數關于施肥對土壤微生物組的研究集中于細菌和/或真菌群落上，原生生物、古菌等微生物在土壤生態系統中也起到舉足輕重的作用，其對有機肥和無機肥的不同響應研究需要被重視。不同有機-無機施肥處理下絕非是單一類型微生物的變化，微生物組的綜合分析才能更為全面地揭示復雜的土壤微生態。

4.4 微生物功能的探究

微生物組成及其功能多樣性對于生態系統穩態的維持和修復起著至關重要的作用［80]。前人的研究更多的集中在施肥處理如何影響土壤微生物組成，對其影響土壤微生物功能尚缺少充分的闡述。不同類型的微生物在土壤微生物網絡中發揮著各自的功能，各司其職，不同功能的微生物協同調控才能使肥料養分得以高效利用。微生物功能的探究能讓我們進一步了解不同施肥處理下土壤的運作機制，指導農業生產合理施肥和可持續發展。

綜上，無機肥可增加土壤速效養分含量，提高土壤肥力；有機肥可改良土壤物理結構，提高土壤肥力儲蓄，改善土壤微生物組的豐度和多樣性及菌群結構，有機-無機肥配施將是保證農業作物可持續發展的重要舉措。不同的作物種類、不同的土地利用類型、不同來源和成分的有機無機肥也決定最佳配施比例并不唯一，因此測土配方施肥、有機-無機精準配施將是未來農業生產的科學施肥方式。