表面活性劑對纖維素酶解的影響及機理

張家順 高麗莉 馬江山 劉高強

（1. 中南林業科技大學林業生物技術湖南省重點實驗室，長沙 410004；2. 中南林業科技大學森林資源生物技術湖南省國際科技創新合作基地，長沙 410004；3. 甘肅農業職業技術學院，蘭州 730020）

木質纖維素生物質是一種豐富的可再生資源，然而由于植物細胞壁對微生物和分解酶的天然抗性使其難以被有效利用［1]。與物理、化學等方法相比，利用纖維素酶進行酶解糖化具有條件溫和、利于環保，且不產生后續發酵抑制物等優點［2]。但目前纖維素酶普遍存在酶解效率低、酶負荷大等問題，導致實際使用成本過高，不利于生產［3-4]。為解決這一問題，各國學者采取了多種策略，包括添加酶助劑［5]、篩選微生物以尋求性能更好的新型纖維素分解酶［6-7]、酶的定向進化和蛋白質工程［8]以及提高預處理技術和酶的再利用等［9]。表面活性劑（Surfactant，SF）是一種兩親性分子，含有一個憎水基團和一個親水基團，具有兩性分子的結構特征使其表現出乳化、浸潤、分散和增溶等多種特性，是一種理想的酶助劑。研究發現，添加SF可以顯著提高纖維素的酶水解率。根據極性基團的解離性質，SF可分為離子型和非離子型，離子型SF根據解離后的電荷，又可分為陽離子型、陰離子型和兩性離子型。大量研究表明，對纖維素酶解的促進效果最好的是非離子型SF，如典型的吐溫和聚乙二醇，因其具有穩定性高、相容性好和溶解性強等優點，可以顯著提高纖維素水解率［10-11]。也有研究把陰陽離子表面活性劑進行復配，尋找新型表面活性劑［12-13]，進一步改善SF對纖維素酶解的促進作用。根據來源的不同，SF又可分為化學表面活性劑（Chemical surfactants，CSF）和生物表面活性劑（Biosurfactant，BSF）。BSF是一類由微生物、植物或動物產生的具有一定表面活性的兩性物質［14]，相對CSF具有無毒、可降解等優點，且具有更高的表面活性和較低的臨界膠束濃度，以及更強的pH穩定性、乳化能力和抗黏附活性。

雖然添加SF可以顯著提高纖維素酶解效率，增加還原糖產量，但不同類型的SF對纖維素的酶解具有不同的影響，且SF的作用效果受到底物結構、水解條件和酶的組成等多方面的影響。SF對纖維素酶解的影響機理也尚不完全清楚，普遍認為其能減少纖維素酶在木質纖維素表面的無效吸附、提高纖維素酶的穩定性和活性及改變底物結構特性等。因此，本文從上述幾個方面對表面活性劑對纖維素酶解的影響及機理的研究進展進行綜述，旨在為木質纖維素生物質的酶解轉化研究提供理論借鑒。

1 影響表面活性劑作用效果的因素

大量研究表明添加SF可顯著提升纖維素的轉化率，提高酶的穩定性，增加還原糖產率［15-16]。Parnthong等［17]在 棕 櫚 果 串（Palm fruit bunch，PFB）中添加濃度為0.25%（W/V）的Tween-80，還原糖產量增加約50.5%，并發現Tween-80能吸附在木質素的疏水表面上，從而促進纖維素酶在纖維素上的吸附，進而提高纖維素的酶解率。類似的，Kim等［18]研究發現，SF對不含木質素的底物酶解也有較大的提高。在α-纖維素和濾紙的酶解過程中加入0.5%的Tween-80，72 h后可以將轉化率從59.4%和69.2%分別提高到81.3%和91.2%。Li等［19]發現隨著SF用量從0增加0.06 g/g DS（干物質質量比），葡萄糖產率迅速增加，而當SF用量超過0.06 g/g DS時，葡萄糖產率略有降低。這可能是由于過量的SF達到了臨界膠束濃度發生自凝聚，形成的膠束抑制了酶與底物接觸，從而降低了葡萄糖的產率［20]。Cai等［21]發現PVP-8000比 PEG、Tween等傳統 SF的效果更好。其研究表明，PVP-8000在木質素上的吸附量較大，吸附層更穩定、更親水，降低了纖維素酶在木質素上無效吸附的73.1%。因此，大大提高了木質纖維素的酶解率。但SF性能的優劣既取決于其分子結構的特點（即極性基團和非極性基團的組成），又受到底物結構、酶的組成及各種水解條件，如pH、轉速、底物濃度等的影響。

1.1 底物對表面活性劑作用效果的影響

底物不同，其纖維素、半纖維素及木質素的含量也不同，SF與底物的相互作用亦不同，因此對酶活的影響也不盡相同。Sipos等［22]在6種木質纖維素酶解中添加了PEG-4000，研究發現僅對云杉、柳樹、大麻有促進作用，而對玉米、小麥的秸稈和高粱渣的酶解沒有明顯的改善。同樣的，Rocha-Martin等［3]采用高固含量和低酶用量等工藝條件，對預處理玉米秸稈、甘蔗秸稈和微晶纖維素進行水解。結果表明，加入PEG-4000可使3種材料的葡萄糖產率分別提高10%、7.5%和32%。這可能是不同類型的木質素通過不同的機制抑制酶水解。Li等［23]研究發現，纖維素酶在有機溶膠木質素上無效吸附，減少了降解纖維素的有效酶，從而降低了水解速率和最終還原糖產量。硫酸鹽木質素沉積在纖維素表面，抑制其與纖維素酶接觸，而分子量影響木質素的抑制作用。小分子木質素溶解性較好，與酶結合后形成的復合物仍處于水相，只導致少部分（10%）的酶失活，纖維素酶仍能進入底物內部與纖維素結合并水解纖維素，但大分子木質素與酶結合后，復合物可能無法有效地進入纖維素內部，形成一定的空間排斥現象，阻止纖維素酶進一步水解纖維素，當大分子木質素較多沉淀在纖維素表面時，這種空間排斥作用將更加明顯。另外，核磁共振分析表明，木質素的結構特征，如官能團等決定了木質素在酶解過程中的吸附能力，高含量的脂肪族羥基或低含量的羧基導致高的表面疏水性，增加木質素和酶之間的無效吸附。因此，不同底物的木質素結構特征及含量均不相同，影響纖維素酶與纖維素有效結合的方式亦不同，表面活性劑因能與底物結合，改變其結構特性，如疏水性、電負性及空間位阻等，因而改善了纖維素酶在底物上的吸附性能，提高了纖維素的水解率。

對于純纖維素來說，纖維素對纖維素酶的可及度是限制酶解的主要原因，也是影響SF作用效果的重要因素。Mizutani等［24]研究發現，Tween-20對Avicel、Tencel等結晶度較高的纖維物質的酶解有促進作用，而對結晶度較低的銅氨人造纖維沒有促進作用，認為可能是SF抑制了內切酶在纖維素表面的無效吸附，從而使得外切酶更容易進入纖維素鏈的末端。而有研究者有不同的發現，Gupta等［25]研究發現聚合度影響外切酶的活性，外切酶不能水解較低聚合度的纖維素，因而聚合度高的纖維素底物反而水解率更高，并認為提高底物的表面積和反應位點的數目有利于酶的吸附，從而提高水解的初始速率。因此，纖維素的結構特點，如結晶度、聚合度等均會影響纖維素的可及度，進而影響纖維素酶（外切酶和內切酶）的吸附性能，因而SF的作用效果亦不相同。

1.2 水解條件對表面活性劑作用效果的影響

木質纖維素的酶解是一個固液兩相反應過程，除了木質纖維素的結構特性，水解條件、固液兩相傳質效率等同樣會影響SF的作用效果。Lou等［26]發現，pH值升高能顯著增強木質素的表面電荷（負電荷），導致木質素變得更加親水，并降低其與纖維素酶結合的親和力，從而減少纖維素酶的無效吸附，進而提高纖維素的轉化率。Wang等［27]也有相似的發現，將緩沖液的pH由5.0提高到5.5時，陰離子型SF木質素磺酸鈉能將木質纖維素的72 h轉化率提高10%。因此，pH值影響底物、酶的表面性質，也影響SF對酶解的作用效果。而有研究者表示，在最佳水解條件下，SF對纖維素酶水解的促進作用并不明顯，但在苛刻條件下（高轉速、高固液比等）可以提高纖維素的轉化。Yang等［28]發現在轉速為0 r/min、100 r/min時，Tween-80對純纖維素轉化率的影響很小，然而，當轉數增加到180 r/min時，Tween-80使得纖維素轉化率從 35% 提高到 45%。類似的，Okino等［29]比較了攪拌和靜置條件下Tween-80的添加對濾紙水解反應速率的影響，發現在攪拌條件下水解速率明顯增加，然而在靜態條件下并沒有增加，認為Tween-80能防止纖維素酶在攪拌條件下失活。另外，含水量（固液比）影響物質的傳質效率，高固液比能夠提高酶解糖濃度以及后續發酵的產物濃度，減少廢水產生，但會降低纖維素酶的轉化率、增加能耗等［30]，添加SF有助于這一問題的解決。Ma等［31]研究了SF與底物濃度的關系發現，Tween-80在低固液（10%）比條件下，對纖維素酶的促進作用并不顯著，而在高固液比（25%）條件下能顯著提高纖維素酶的轉化率（提高90%）。這可能是苛刻條件下纖維素酶更易受到液體剪切力作用而失活，SF因能通過相互作用力保護纖維素酶不受剪切力影響，從而提高了纖維素酶的轉化率［28，32]。

1.3 SF的種類和濃度對其作用效果的影響

SF的種類和濃度對纖維素酶解的促進效果也有顯著影響。Ouyang等［33]發現，在Avicel 的水解體系中添加0.03 g/g和0.05 g/g的PEG-4000其轉化率分別提高了69.8%和78.9%，然而繼續增加濃度（0.08、0.11和0.14 g/g）并沒有進一步提高轉化率。研究發現，聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）的疏水基團和親水基團可分別與木質素的苯基和甲基相互作用，從而在木質素上形成水合層，抑制了木質素與纖維素酶的無效吸附，因而提高了纖維素的酶水解率［34]。類似的，Cai等［35]發現隨著陽離子型SF十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）濃度的增加，微晶纖維素的72 h水解率呈現先升高后降低的趨勢。當CTAB濃度超過0.1 mmol/L時，微晶纖維素的72 h水解率出現顯著下降，加入1 mmol/L的CTAB后，微晶纖維素的72 h水解率僅為8.3%。同樣的，Alhammad 等［36]研究了4種非離子型SF（PEG-4000、PEG-8000、TitronX-80和Tween-100）對纖維素酶解楊木的影響，發現添加1%（W/W）SF時，在PEG-4000存在下酶解有58.5%的最大葡萄糖產率，而在TritonX-100存在下只產生40.3%的最低葡萄糖產率。然而，除了TritonX-100，SF濃度增加到5%和8%時，均沒有使葡萄糖產量進一步提高，表明SF的種類和濃度均對纖維素酶的水解產生顯著的影響。

1.4 纖維素酶對表面活性劑作用效果的影響

纖維素酶的來源與組成也是影響SF作用效果的重要因素。來源與組成不同的纖維素酶，其分子量、疏水性及所帶電荷亦不同，均會影響SF與酶的相互作用，進而影響酶與纖維素之間的吸附性能以及不同酶組分間的協同作用，從而對酶水解的效率和還原糖產率產生影響。Zhou等［37]對來源不同的纖維素酶，在加入同一種SF的情況下比較了其CMCase和FPase酶活的活性大小。研究發現，當添加量為0.5 g/L時，TritonX-114和Tween-80能大大提高纖維素酶II（EbSL OH，德國）對濾紙的120 h轉化率，而對羧甲基纖維素沒有或甚至輕微的負面影響；相反，SF能促進纖維素酶Ⅲ（山東大學，中國）對羧甲基纖維素的水解，但對濾紙水解沒有影響；而用纖維素酶I（Novo.s，丹麥）水解時，SF對羧甲基纖維素和濾紙都沒有顯示出積極的效果。

綜上所述，SF對纖維素酶的促進作用受到諸多因素的影響，在利用SF提高酶解效率時應選著合適的種類及濃度范圍，并注意各種水解條件，以達到最佳的處理效果。

2 表面活性劑對纖維素酶解影響的作用機制

SF對纖維素酶解影響的作用機制較為復雜，尚未形成系統理論，總的來說是由SF、底物與酶三者之間通過各種分子間作用力，包括疏水相互作用、離子鍵、氫鍵等引起的酶吸附性能和酶活性的改變，可以從以下3個方面解釋：（1）SF吸附在木質素上降低纖維素酶在木質素上的無效吸附（圖1）；另外，可通過與纖維素酶和底物相互作用，分散纖維素酶聚集體并抑制纖維素酶在底物上的過量吸附，來降低纖維素酶在纖維素上的無效吸附（圖2），從而使溶液中的游離酶含量提高，并能促進纖維素酶與纖維素結合，提高纖維素酶的水解效率。（2）通過與纖維素酶競爭氣液界面和降低液體剪切力抑制纖維素失活，提高纖維素酶的活性與穩定性，進而提高了纖維素的酶水解率（圖3）；（3）改變底物結構特性，增加底物的可及度和酶的結合位點（圖4）。

2.1 減少纖維素酶的無效吸附，并促進纖維素酶

與纖維素結合，提高纖維素的酶解效率

圖1 表面活性劑抑制木質素對纖維素酶無效吸附的機理

圖2 表面活性劑抑制纖維素對纖維素酶無效吸附的機理

圖3 表面活性劑在防止纖維素酶失活中的作用機理

圖4 表面活性劑增強纖維素酶對纖維素的可及度

纖維素的酶解過程包括酶在纖維素上的吸附、水解和脫吸附3個步驟，而木質素是一類具有強疏水性的物質，木質素的存在會影響木質纖維素的疏水性質，即影響纖維素酶的吸附與脫吸附性能。纖維素酶的吸附分為兩種：特異性吸附和非特異性吸附。特異性吸附是由纖維素酶中的結合域（Cellulose binding domain，CBD）完成的，并能將纖維素鏈送到纖維素酶催化域（Catalyse domain，CD）中進行催化酶解；而非特異性吸附是酶與底物之間的相互作用造成的，如氫鍵、靜電作用和疏水相互作用等，不參與酶解反應，即為無效吸附［38-39]。有研究表明木質纖維素對酶的無效吸附是導致水解率不高的重要原因之一。Jiang等［40]研究了非離型SF Tween-80對纖維素酶在模型木質素底物上吸附的影響，用石英晶體微天平和耗散監測分析了Tween-80和纖維素酶在木質素底物上的吸附發現，Tween-80主要通過分散作用（≥85%）快速吸附在木質素底物上并促進木質素分子的增溶。Tween-80吸附在木質素上能增強木質素的極性表面能，使木質素表面更加親水，從而降低了纖維素酶在木質素上的吸附。同樣的，Cai等［41]使用木質磺酸鹽和（3-氯-2-羥丙基）三甲基氯化銨合成了一種新型表面活性劑（Quaternization of sulfonated lignin，SLQA），并研究了其對桉木酶解的影響發現，SLQA比木質素磺酸鹽有更顯著的促進作用，SLQA吸附在木質素表面可以提高木質素的親水性，形成更有效的空間位阻和水化層，減少對纖維素酶的無效吸附，從而促進纖維素的酶解。Lin等［42-43]將SF進行復配，把木質素磺酸鹽基聚氧乙烯醚（Lignosulfonate-based polyoxyethylene ether，LS-PEG）與陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨結合發現，LS-PEG的磺酸基能通過靜電吸引優先與CTAB的季銨基相互作用，形成具有非離子表面活性的配合物CTAB-LS-PEG。CTAB-LS-PEG表現出電中性和疏水性，從而加強了對纖維素酶在木質素上無效吸附的抑制作用，使得新型SF配合物對木質纖維素酶解效率的提高更為顯著。

也有研究者有不同的發現，Li等［44]認為，內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶首先以結合結構域吸附在纖維素底物上，大部分催化結構域與纖維素反應，當大量纖維素酶吸附在纖維素上時，由于過于擁擠，纖維素酶的催化結構域發生重疊，不能被充分利用。聚乙二醇是一種在水溶液中具有不穩定性和無規則卷曲構象的線性聚合物，由于它吸附在纖維素上抑制了纖維素酶的過量吸附，因而使得吸附在纖維素上的纖維素酶得以充分反應，從而提高了對不含木質素的微晶纖維素（Avicel）的酶水解率。因此，證實了PEG-4000不僅可以減少纖維素酶在木質素的無效吸附，而且對纖維素也同樣有效。類似的，Lin等［45]發現木質素磺酸鹽（Lignosulfonate，LS）與十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）的配合物LS-CTAB可以顯著提高木質纖維素的水解率。首先，LS通過靜電作用或疏水作用吸附在纖維素酶聚集體上，分散纖維素酶聚集體形成更小和更親水的LS-纖維素酶聚集體，減少纖維素酶聚集體在纖維素上的無效吸附。然后，CTAB吸附在LS-纖維素酶聚集體上將其強負電荷調節為弱負電荷，弱負電荷有利于纖維素酶與帶負電荷的纖維素相互作用，進一步提高纖維素的轉化率。

2.2 提高纖維素酶的穩定性與活性

纖維素酶的失活是影響木質纖維素生物質發展的重要原因之一。在攪拌的液體環境里，纖維素酶由于液體剪切力作用容易失活，而底物的存在與否對酶活也有很大影響，一般而言，在無底物存在的條件下，纖維素酶的機械穩定性較好。另外，當酶處于氣液界面時，失活也將加劇。研究發現，SF可以提高纖維素酶的穩定性，通過抑制酶失活來促進纖維素的酶解。Xin等［46]通過研究玉米秸稈和云杉的酶解動力學特征發現，纖維二糖水解酶（外切葡聚糖酶）的失活是纖維素酶總活力損失的主要原因，而Tween-80是纖維二糖水解酶特異性的激活劑。在含0.5 mg/mL木質素、0.5 mg/mL半纖維素和0.5 mol/L半纖維素低聚物的混合物中加入纖維二糖酶，發現原纖維二糖酶活損失了60%，而Tween-80的加入使損失的活性恢復了約40%。這表明Tween-80能在消除木質素、半纖維素及其衍生物對纖維二糖水解酶的抑制作用方面表現出特異性的積極作用，從而在酶解過程中維持酶的高活性。

Lou等［47]進一步研究發現，在高攪拌速率的情況下SF對纖維素酶解的促進作用反而更顯著。研究纖維素酶溶液的表面張力，發現緩沖液、PEG-4600溶液及纖維素酶溶液的表面張力分別為70.1 mN/m、63.3 mN/m和55.5 mN/m，這表明纖維素酶和SF均會在氣液界面上聚集。由于纖維素酶暴露于氣液界面時，纖維素酶分子的疏水部分會伸展到空氣中，而親水部分則浸沒在水中，這種不平衡的作用力會導致纖維素酶的折疊，從而失去活性。雖然SF在氣液界面聚集的能力沒有纖維素酶強，但能和纖維素酶競爭氣液界面，從而阻止部分纖維素酶在氣液表面聚集，進而減少氣液界面上的纖維素酶分子的數量，抑制酶的失活［48]。另外，研究纖維素酶溶液的流變特性，結果顯示加入PEG-4600的纖維素酶溶液剪切力低于沒有PEG-4600的纖維素酶溶液（由8.4 Pa降低到7.6 Pa），這表明PEG-4600可以在高攪拌速率下降低纖維素酶溶液的剪切力，進而減少了由剪切力作用導致的酶的失活。纖維素酶分子在高攪拌速率下受到強烈的剪切力和沖擊力，在纖維素酶分子上的瞬時力可能是不平衡的，這將導致纖維素酶結構的變化而失活。非離子表面活性劑在纖維素酶分子表面的吸附可能與氫鍵和疏水相互作用有關［49]，而具有極性的親水性基團（如PEG分子中的醚基）可以通過與水的氫鍵形成致密的水化殼［50]。該水化殼具有潤滑作用，能夠降低剪切力和沖擊力對纖維素酶分子的影響，從而提高了纖維素酶的穩定性。同樣的，Kaar等［51]研究發現，SF的存在降低了溶液表面張力，通過減少“多余的表面”阻止纖維素酶在氣液表面與空氣接觸，使纖維素酶更加穩定。另外，SF還可通過與纖維素酶競爭自由表面區域阻止纖維素酶在氣液交界面上的變性。在高攪拌速率（200 r/min）和低固載條件下，纖維素酶濃度相對較低，更容易因剪切力和氣液界面而失活，因此非離子表面活性劑對酶解的促進作用更加顯著。

2.3 改變底物結構特性，增加底物的可及度和酶的結合位點

如前所述底物的結構特點對纖維素的酶解有著顯著的影響。研究發現，SF可以通過改變底物結構的性質來促進纖維素的水解。Seo等［52]研究發現，除木質素含量高、結晶度高外的大多數樣品的細胞壁，在添加Tween-20后會塌陷，造成10-50 nm孔洞的形成，不僅使纖維素酶的單層飽和吸附量增加3-3.6倍，而且使纖維素酶的吸附速率增加160-880倍，纖維素72 h轉化率也提高了8.7%-21.5%，并認為為了獲得Tween-20的結構效應，需要對樣品進行某種程度的預處理（如木質素去除），以加強Tween-20向樣品中的擴散。而Kim等［53]使用掃描電鏡觀察發現，Tween-80能使纖維素濾紙膨脹，表面出現裂紋，變得無序易剝落，因此增加了其與纖維素酶的接觸面積，從而提高纖維素酶的吸附性能。相似的，Helle等［54]認為SF可以改變纖維素的超微結構以增加纖維素酶對其攻擊的脆弱性。Lin等［55]使用耗散監測石英晶體微天平（Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring，QCM-D）和原子力顯微鏡（Atomic force microscopy，AFM）研究了SF配合物EHL-PEG對纖維素膜酶解動力學的影響發現，EHL-PEG能在纖維素膜表面開鑿出大量空腔，使膜更加疏松、暴露，達到最大酶解速率后，纖維素膜被逐層剝落，直至平衡，因而增加了纖維素酶的接觸位點，提高了纖維素酶的酶解效率。

另外，拉伸強度的損失被認為是決定纖維素織物物理性能的主要因素之一。Hemmatinejad等［56]測定了纖維素織物的拉伸強度和折皺回復角等物理性能發現，5種SF在同一濃度下，分別使纖維素織物的拉伸強度降低了5%、7%、8%、8%和17%，而對應纖維素織物水解釋放的還原糖含量也呈逐漸增加的趨勢。表明表面活性劑，尤其是非離子表面活性劑，能通過降低底物結構的拉伸強度來提高纖維素的酶水解率。

SF可以改變底物一定的結構性質，使其更易與纖維素酶發生反應，但相互作用的分子機理尚不清楚，且纖維素底物的結構包括聚合度、結晶度、可及度以及纖維素與半纖維素、木質素的交聯互相影響，較為復雜，不能孤立考察，今后需更進一步地深入探究。

3 總結與展望

木質纖維素生物質的利用具有極大的應用前景，提高纖維素酶的水解效率與還原糖產量，對木質纖維素生物質的有效利用有重大意義。SF對纖維素的酶解有顯著的促進作用，然而SF、纖維素酶與底物三者之間相互作用較為復雜，諸多因素均會對其作用效果產生影響（圖5）。目前，SF對纖維素酶解的影響機制多停留在宏觀方面，為發揮SF的最大作用，需進一步從以下幾個方面深入探究SF對木質纖維素酶解的影響規律及微觀作用機制：（1）SF是通過何種作用力與底物結合的，對底物的表面電荷及親水性有什么影響，是如何影響纖維素酶與底物結合的；（2）SF與纖維素酶之間的分子作用力有哪些，是如何影響酶的活性和穩定性的，如何減少酶因與底物相互作用而導致的失活的；（3）SF是如何影響液體表面張力和剪切力，進而提高酶的穩定性的；（4）探究SF與底物間的分子作用力，是如何改變底物微觀結構的，綜合考察SF對底物結構，包括聚合度、結晶度、可及度及拉伸強度的影響。

圖5 表面活性劑促進纖維素酶解的關系圖