MHC區域HLA-B類基因與抗癲癇藥誘發重癥藥疹的相關性研究

張祥，儲海峰，胡白，陸聞生

[1 .皖南醫學院，蕪湖 241002；2.中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)皮膚性病科]

史蒂文斯-約翰遜綜合征(SJS)、中毒性表皮壞死綜合征(TEN)，剝脫性皮炎型藥疹(ED)及超敏反應綜合征(HSS)等嚴重皮膚藥物不良反應(cADRs)嚴重威脅人類的健康和生命[1]。嚴重皮膚藥物不良反應又稱重癥藥疹，其發病機制復雜，可能與變態反應、遺傳等多種因素有關，其中最常見的誘發因素是服用抗癲癇藥物。重癥藥疹患者可引起敗血癥和呼吸衰竭，有高達30%的死亡率[2]，通常被認為是不可預測的。雖然有研究表明[3-4]攜帶HLA-B*1502等位基因人群服用卡馬西平誘發SJS和TEN危險性增加，幾乎達到100%，而在輕度藥物不良反應患者很少攜帶。然而,在一些研究中[5-6]，卡馬西平誘發的部分SJS和TEN患者卻并未攜帶HLA-B*1502等位基因，這表明除了HLA-B*1502等位基因，攜帶HLA-B其他等位基因也可能誘發重癥藥疹。目前還不清楚，攜帶HLA-B*1502等位基因人群服用其他抗癲癇藥物如苯巴比妥及拉莫三嗪是否會出現重癥藥疹。本研究主要通過測定服用抗癲癇藥物的重癥藥疹患者外周血相關HLA-B等位基因，探討HLA-B等位基因與重癥藥疹的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 耐受組成員之間與病例組成員之間均無血緣關系。

病例組：選自安徽省立醫院2014年5月至2018年6月入住皮膚科及相關科室病房，確診的史蒂文斯約翰遜綜合征、中毒性表皮壞死綜合征，史蒂文斯約翰遜綜合征-中毒性表皮壞死綜合征重疊型患者，診斷參照第8版《皮膚性病學》[7]，共25例。患者除服用抗癲癇藥12周內未服用其他藥物，患者之間沒有血緣關系，都在疾病的急性期，并有典型的皮損表現。男9例，女16例；年齡范圍14～81歲，年齡(49.8±7.6)歲。所有患者對研究內容具有知情權并簽署知情同意書。

耐受對照組：耐受對照來自安徽省立醫院神經外科、神經內科服用卡馬西平、苯巴比妥和拉莫三秦3個月內未引起藥疹的住院患者，共50例。年齡、性別與病例組相匹配[男19例，女31例；年齡范圍29～78歲，年齡(51.5±9.7)歲]。

1.2 研究方法 標本采集:從病例組和耐受對照組采集外周靜脈血2～5 mL于EDTAK3抗凝管中，稍放置后置于離心機中離心(3000 r/min，3 min)，將血清提取至凍存管中，然后存放于-80 ℃冰箱，血細胞留置在管中存放于4 ℃冰箱備用。

DNA提取: DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司生產)。

引物設計與合成: 通過查閱文獻，本研究選取了5個與免疫性疾病相關性較高的HLA-B等位基因，分別如下：HLA-B*15:02、-B*40:01、-B*58:01、-B*13:01和HLA-B*38:02，采用PCR-特異性引物(PCR-SSP)方法進行分型。HLA-B基因擴增的引物序列參考文獻中的序列[8]。

結果判斷以及質控: PCR反應設置陽性對照(測序確定是同一亞型的樣本)與陰性對照(不加DNA模板)，且每一個反應孔均添加一對保守的內參引物。當陽性對照正常出現、陰性對照表現為陰性時，若僅出現內參照帶則為陰性，內參照帶及目的條帶都出現則為陽性，只有目的條帶出現也為陽性。

1.3 統計學處理 通過PLINK 1.07軟件分析比較兩組的等位基因頻率，比較各組的P值、相對危險度用優勢比(OR值)、95%置信區間(95%CI)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的臨床特征 總共25例患者被收集(男性占36%)，重癥藥疹發病的年齡是(49.8±7.6)歲(范圍14～81歲)，其中14例是由于服用卡馬西平，11例服用其他抗癲癇藥誘發(其中包括5例苯巴比妥和6例拉莫三嗪)。25例患者完成了基因分型，50例服用抗癲癇藥物未出現藥疹的人群被作為耐受對照組，他們的年齡是(51.5±9.7)歲(范圍29～78歲)，男性占38%。

2.2 HLA-B等位基因分型結果 病例組與耐受對照組分型結果見表1,2。在病例組中最常見的等位基因頻率為HLA-B*1502(64%)，HLA-B*13:01 (12%),和 HLA-B*38:02 (8%)。而在耐受對照組最常見的等位基因頻率為HLA-B*40:01 (32%),HLA-B*58:01 (18%) 和HLA-B*15:02(14%)。總的來說，病例組攜帶HLA-B*1502等位基因要顯著高于耐受對照組(P=9.6×10-6，OR=10.92，95%CI:3.07～41.00)。HLA-B*1502攜帶率，很大程度是由卡馬西平引起，服用卡馬西平誘發重癥藥疹的患者相比服用卡馬西平耐受組攜帶HLA-B*1502攜帶率顯著高(P=7.0×10-6，OR=36，95%CI:4.65～375.97),這種HLA-B*1502攜帶率增高趨勢在苯巴比妥誘發重癥藥疹患者也存在(P=0.013，OR=45，95%CI=1.47～7827.55)，但在拉莫三嗪組沒有相關性(P=0.879，OR=0.33，95%CI=0.01-8.01)。病例組攜帶HLA-B*40:01等位基因低于耐受對照組(P=0.045，OR=0.18， 95%CI：0.03～0.97)。

表1 兩組HLA-B各等位基因的情況

表2 服用不同抗癲癇藥物在病例組與耐受對照組中的HLA-B*15:02等位基因分布

3 討論

關于重癥藥疹的病因及發病機制已有許多文獻述及，目前免疫學說是研究熱點[9]。人類白細胞抗原(HLA)，是由一系列緊密連鎖的基因座位所組成的具有高度多態性的復合遺傳系統，每一個基因座位都有很多共顯性等位基因。HLA不但在免疫反應中起重要的作用，而且還具有單倍體遺傳、高度多態性、連鎖不平衡性等遺傳特征。

本研究通過PCR-SSP的方法對HLA-B等位基因進行分型，采用病例對照研究分析了這些HLA-B等位基因與重癥藥疹發病的相關性。對于多等位基因比較采用bonferi校正P值的方法,以減少多重比較引起的誤差導致的假陽性。為了反映關聯的強度,同時計算了OR值及可信區間,OR值指某事物發生與不發生的概率之比,可以反映某因素與疾病的關聯程度,如小于1,則該因素與疾病成負相關,如大于1,則該因素與疾病成正相關,值越大,說明關聯的程度越強。

通過HLA-B基因分型，本組證實了前期相關研究結果，HLA-B*1502與抗癲癇藥物誘發的重癥藥疹有相關性。本組發現這種相關性主要與卡馬西平密切相關，這與中國臺灣相關研究[10]結果相似。本組研究結果進一步支持HLA-B*1502應該作為一個藥物基因生物標志，在服用卡馬西平之前應該接受該等位基因檢測，從而避免攜帶該等位基因人群服用卡馬西平發生重癥藥疹。抗癲癇藥物中出現交叉反應是很常見的現象。在相關的研究表明苯巴比妥和拉莫三嗪與重癥藥疹具有相關性，但結果并不一致，這可能與研究的患者數量小有關，需要Meta分析進一步證實[11-12]。最近對卡馬西平及有類似結構的藥物體外實驗表明，卡馬西平與HLA-B*1502之間的相互作用及對T細胞的刺激5-羧氨基起著至關重要的作用。雖然抗癲癇藥物都具有芳香環結構，但拉莫三嗪和 苯巴比妥都不具有羧基，而丙戊酸鈉和加巴噴丁不具有芳香環結構。這些抗癲癇藥物之間結構的差異可以很好地解釋HLA-B*1502與嚴重的藥物不良反應發生在不同的抗癲癇藥的差異。除了HLA-B*1502外，HLA-B*1508在印度人群[13]，HLA-B*1511、 HLA-B*1518在日本人群[14-15]，也有報道[16]HLA-B*1521與卡馬西平引起的SJS和TEN有相關性。這種現象可能是與HLA-B*1502相似的氨基酸序列的同源性可能引發類似嚴重藥物反應[17]。有幾項研究也表明某些HLA等位基因對卡馬西平誘發重癥藥疹具有保護作用，與卡馬西平耐受對照組相比，在病例組攜帶頻率較低，這其中包括HLA-B*40:01。一種HLA等位基因可能會增加由一種藥物引起的嚴重藥物反應，卻會降低其他藥物引起相同表型嚴重藥物反應的風險[18]。最近全基因組關聯研究表明等位基因變異、Th1/ Th2平衡關系，相關炎性反應在哮喘和自身免疫疾病存在相反的基因關聯方向。對HLA等位基因與嚴重藥物反應的分析可以進一步揭示某種藥物與HLA等位基因分子結合改變了抗原形狀和化學性質的變化，從而改變抗原性和誘發T細胞激活。可以想象相同的HLA分子與不同藥物的相互作用，對下游的肽鏈會產生不同的影響。這一發現也表明，除了HLA等位基因外，其他因素可能與嚴重的藥物不良反應的發病機制有關。T細胞受體(TCR)的大量克隆增殖表明了其對嚴重的藥物不良反應發生機制起重要作用。值得進一步研究的是，同樣或者不同的TCR克隆類型是否會由其他藥物誘發重癥藥疹個體中發現。

總之，HLA-B*1502與卡馬西平誘發的重癥藥疹有緊密的聯系。可能的保護因素HLA-B*40:01與重癥藥疹相關性需要進一步調查。