16S 核糖體DNA 高通量測序研究種植體齦溝液微生物的變化

青薇 黃麗娟 鄭佳俊 任靜 李成龍 庹嬙 任小華 牟雁東,

1.西南醫科大學口腔醫學院 瀘州 646099；

2.電子科技大學醫學院 成都 610054；

3.四川省人民醫院口腔科 成都 610072

種植牙已在國內外廣泛應用于牙列缺損和牙列缺失的患者，相關文獻[1]報道種植體植入后的存留率高。但隨著微生物黏附到種植體相關結構，菌斑控制不佳，會導致種植體周圍黏膜炎和種植體周圍炎，最后導致骨質流失和種植失敗[2-4]。有報道[5]表明，種植體植入5～10年之后，約20%的患者和10%的植入位點發生了種植體周圍炎。

齦溝液中的微生物是種植體周圍齦下微生態體系中的關鍵成分，研究種植體周圍齦下微生物多樣性對于探索種植體周圍炎癥的發生機制有重要意義[6]。作為一種不依賴培養的分子檢測技術，高通量測序具有分辨率高、重復性好等特點[7-8]。近年來，隨著測序技術逐步提高和成熟，高通量測序技術得到了普遍應用，在口腔齲壞、牙周炎和種植體周圍炎微生態的研究也逐步深入。種植體植入后疾病的發展是一個循序漸進的過程，菌群的定植在不同的狀態下必然會有不同的體現[9-10]，基于此，筆者對于健康天然牙、健康種植體及發生種植體周圍炎對象的齦溝液菌群差異進行了研究。

考慮到患者口腔內常駐微生物群的個體差異，選擇在同一個體中研究種植牙健康狀態向疾病狀態轉變時相關微生物群的變化[11]。本研究篩選出10名患者口腔內同時存在健康天然牙、健康種植體以及發生了種植體周圍炎的種植體為3組研究對象，應用16S核糖體DNA（ribosomal DNA，rDNA）高通量測序技術探究3組對象的微生物多樣性，以探討齦溝液微生物菌群的差異，為種植體周圍炎的精準醫療提供一定的依據。

1 材料和方法

1.1 病例資料

本實驗篩選2016年1月—2018年1月就診并接受種植義齒修復的患者，同一受試者口內至少同時存在健康天然牙、健康種植體和發生了種植體周圍炎的種植體，3個月內未使用抗生素和免疫抑制類藥物，1個月內未接受牙周和種植體周治療，全身狀況良好。成功種植體的納入標準為：種植體無動度，X線片示種植體周圍無透射區，垂直向骨吸收不超過種植體1/3，齦溝深度≤3 mm，探診出血（bleeding on probing，BOP）陰性。種植體周圍炎診斷如下：探診深度（probing depth，PD）≥5 mm，BOP陽性，X線片顯示種植體周圍牙槽骨吸收達3個螺紋，所有受試者自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 試驗材料和儀器

30#吸潮紙尖（登士柏公司，美國）；1.5 mL eppendorf（EP）管（Axygen公司，美國）；低溫冰箱（青島海爾集團）；高速臺式離心機（Thermo Fisher Pico-21；Thermo Fisher Scientific公司，美國）；E.Z.A.N.Mag-Bind Soil DNA試劑盒（Omega公司，美國）；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒（Life Technologies公司，美國）；Taq DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工生物有限公司）。

1.3 樣本采集

由同一位口腔醫師經技術培訓后采集齦溝液。標本的采集時間均為上午（采集當日要求受試患者暫停刷牙等口腔衛生維護措施），刮除預備牙體齦緣區著色菌斑，隔濕條件下用統一規格無菌紙尖浸入頰側近中齦溝40 s采集標本，迅速放入消毒好EP管中（收集樣本時沾有血漬和被唾液污染的樣本排除），做好標記，置入-80 ℃冰箱中備用。

1.4 操作方法

1.4.1 齦溝液細菌16S rDNA V1-V3基因片段多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增 按照提取試劑盒相關步驟進行總DNA提取，溶解于100 μL去離子水，利用Qubit 2.0檢測試劑盒對基因組DNA精確定量。

PCR所用引物已經融合了Miseq測序平臺的V1-V3通用引物：V1F引物（5’ATCTGAGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和V3R引物（5’GAGAATTCCAACCGCGGCKGCTGGC-3’）。50 μL PCR反應體系：上游引物和下游引物各2 μL，Dream Taq PCR Master Mix 25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，然后進入35個循環擴增階段，每個循環包括變性95 ℃ 40 s，退火58 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 1 min，最后于72 ℃保溫7 min。PCR結束后，引入Illumina橋式PCR兼容引物進行第2次擴增，利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，然后按照1：1等量混合后測序。

1.4.2 齦溝液細菌16S rDNA基因測序 齦溝液微生物擴增DNA送至上海生工生物工程有限公司進行Illumina HiSeq 2500高通量測序。

1.5 生物信息學分析

利用Uparse軟件對所有樣品的全部有效序列（effective tag）進行聚類[12]，以97%的一致性將序列聚類成為運算分類單位（opera tional taxonomic units，OTU）；對OTU代表序列進行物種注釋，用Mothur軟件和GreenGene數據庫進行物種注釋分析（設定閾值為0.8～1.0），構建稀釋曲線，利用QIIME軟件計算樣品Alpha多樣性值[13]。

1.6 統計學方法

組間Alpha多樣性兩兩進行獨立樣本t檢驗，菌群水平差異兩兩進行Wilcoxon秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者基本特征及臨床檢查指標

納入實驗研究對象共10名，其中男性6名，女性4名，年齡（60.1±1.7）歲；共收集30份齦溝液，分別編號為健康天然牙組（H組）、健康種植體組（HI組）以及種植體周圍炎組（PI組）。患者基本特征及臨床檢查詳見表1。

表1 患者基本特征及臨床檢查指標Tab 1 Characteristics of patients and clinical data

2.2 測序結果質量分析

通過對30個樣品進行測序，原始序列條數為764 678；過濾掉低質量的序列后，有效序列的總數為764 230，產生1 906～3 132個OTU，有效序列比例均大于98%；質量篩查之后序列長度大部分分布在400～600 bp，平均長度均在440 bp以上，滿足分析要求（圖1）。從稀釋曲線（圖2）中可知，序列數量到1 500時，各樣品稀釋曲線均基本趨于平緩，說明取樣合理，能夠較真實地反映齦溝液樣本的細菌群落。

圖1 原始數據長度分布圖Fig 1 Length of distribution of raw reads

圖2 樣本稀釋曲線圖Fig 2 Rarefaction curves of three groups

2.3 各樣品中細菌多樣性及相關性分析

3組樣本的Alpha多樣性指數如表2所示，Shannon指數顯示H組高于PI組（P＜0.05），HI組高于PI組（P＜0.01），見圖3。

圖3 3組的Shannon指數差異Fig 3 Shannon indices in three groups

表2 3組樣本的Alpha多樣性指數Tab 2 Alpha diversity indices calculated for three groups

2.4 主成分分析

由圖4可以看出，H組和HI組的主成分較類似，出現個別交叉，PI組則與H組和HI組相對獨立，基本無交叉，說明PI組的菌群結構相較來說確實存在不同。

圖4 主成分分析Fig 4 Principal component analysis of three groups

2.5 門水平菌群組成分析

3組樣本共檢測到細菌門17個，其中豐度較高的前5個門分別為：厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），具體所占比例如圖5所示。PI組齦溝液中擬桿菌門占比高于H和HI組（P＜0.05）。3組之間的優勢菌門對比如圖6所示。

2.6 屬水平菌群組成分析

在屬的水平上，總共497個類群被分類，部分屬熱圖如圖7所示，可見在PI組中檢出較高的有普氏菌屬（Prevotella）、密螺旋體屬（Treponema）、纖毛菌屬（Leptotrichia）、放線菌屬（Actinomyces）、鏈球菌屬（Streptococcus）和丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）等，且與HI組和H組相應菌屬豐度進行對比，差異存在統計學意義（P＜0.01），對3組相關致病菌屬進行比較，具體如圖8所示。

圖5 樣品在門分類水平上細菌類群比較Fig 5 Comparison of bacterial groups in each sample at pylum level

圖6 優勢菌門的比較Fig 6 Comparison of dominant bacteria in three groups

圖7 屬水平的熱圖比較Fig 7 Comparison of heatmap in three groups at genus level

3 討論

種植體周圍炎作為種植修復后最常見的并發癥，是影響種植修復成敗的重要因素之一，嚴重者甚至導致種植體脫落[14]，因此理解種植體周圍組織從健康至疾病狀態的復雜病因是必要的。牙周病學研究[15]發現，齦溝液量及其成分能夠反映牙周炎癥情況，認為齦溝液量的變化與牙周病的發展有關。齦溝液中的微生物是種植體周圍齦下微生態體系中的關鍵成分，與種植體植入后組織健康有著密切關系。因此，在本次研究中，選擇同一個體對比不同健康狀態齦溝液內微生物群的轉變，共納入10名患者為研究對象。

Illumina Miseq高通量測序平臺的測序原理精確、數據準確度高，用于研究復雜樣品的微生物群落的組成，具有先進性[16]。在16S rRNA克隆文庫法測序的結果中，總測序只有幾百至一千多個克隆[17]。相比而言，高通量測序深度明顯要高于變性梯度凝膠電泳 （denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE）或16S rRNA克隆文庫[18]等方法。

圖8 樣品在屬分類水平上細菌類群比較Fig 8 Comparison of bacterial groups in each sample at genus level

Alpha多樣性是指在一個特定區域或生態系統內的多樣性，經常用物種豐富度來表示，其中Shannon指數反映每個物種個體數占群落中總個體數的比例，Shannon指數越大，則表示該樣品中的物種多樣性更高[19]。H組和HI組的Shannon指數皆顯著高于PI，表明H組和HI組齦溝液中細菌的豐富度和多樣性都要高于PI組，且其差異具有統計學意義（P＜0.05）；PI組細菌表現出較低的多樣性，物種數量最少，這表明種植體周圍炎是一種核心致病菌參與的簡單感染。然而，這些核心致病菌在所有個體中并不相同，表明該疾病是微生物異質的。既往研究[20]發現，疾病狀態下環境微生物群落的多樣性會比健康狀態下的多樣性降低，這可能是因為病原微生物的聚集，從而形成核心致病群體（比如紅色復合體和黃色復合體）。

在細菌門分類水平上，已知厚壁菌、擬桿菌和變形桿菌是牙周炎患者的主要齦下菌門分類[21-22]，本研究結果也證實了3個實驗組中的菌群中以該3種菌門為主，其中擬桿菌門在H和HI組豐度較低，在PI組相對較高，且差異具有統計學意義。雖然變形桿菌和放線桿菌在PI組中出現了數量增高的趨勢，但差異不具有統計學意義；變形菌門是革蘭氏陰性菌的主要菌群之一，是齦下菌群的主要構成成分，其在疾病狀態下增多，這與Koyanagi等[17]的研究結果一致。Koyanagi等[17]對比了6例種植體周圍炎和牙周炎患者的齦下菌斑，表明相較于牙周組織周圍，種植體周圍存在更復雜的微生物組成，而且以變形桿菌為主的幾種細菌是種植體周圍炎的致病菌屬。Kumar等[10]則指出種植體周圍炎是一種以革蘭氏陰性菌為主的微生物導致的感染，但致病菌種類不像牙周炎那么復雜，是一種以個別優勢菌致病的簡單感染。

在細菌屬水平上，某些牙周炎的重要致病菌屬（比如密螺旋體、普氏菌、彎曲桿菌）在本次研究中檢測出為種植體周圍炎的致病菌屬，從某種意義上說明牙周炎和種植體周圍炎的致病菌屬確實相似[23]，但在本次實驗中檢測到種植體齦溝液中一些特殊的優勢菌屬（纖毛菌、變形鏈球菌和丁酸弧菌）。丁酸弧菌是人胃腸道中的丁酸鹽生產者，其作為健康牙和種植牙共有的菌屬尚未見報道，而本次研究在每個種植體齦溝液中均檢測到它的存在，而且與HI組相比，這些物種的水平在PI組中更高。有趣的是，筆者還觀察到丁酸弧菌與密螺旋體之間有很強的相關性（r=0.69），丁酸弧菌的代謝產物異丁酸是密螺旋體的重要生長需求，這可能提示異丁酸的增多，將會有益于密螺旋體的生長，進而促進有害菌群的增殖、聚集，促進疾病狀態的發生。這一發現提示應對齦溝液內丁酸鹽生產者菌屬進行深入研究，探討其致病機制及對治療的影響。

4 結語

綜上所述，本研究采用16S rDNA高通量測序研究了30例健康天然牙、健康種植體和種植體周圍炎病例，共檢測到包含17個門，177個科共497個屬的細菌。健康種植體呈現出豐富的微生物多樣性，與健康天然牙一致；而當種植體周圍組織遭受致病菌引起的炎癥后，表現為相關致病菌豐度增高，而其多樣性下降。與此同時，種植體周圍炎由于受到解剖位置及病理因素的影響，其致病相關微生物與牙周致病微生物存在聯系，但仍可能有其他的致病微生物參與病變的進程。種植體周圍炎優勢菌屬在該疾病發生、發展中的功能值得進一步深入研究。