細胞塊結合免疫組化技術在惡性胸腔積液病理診斷中的應用

趙 帥，肖 琳

(長沙市第三醫院病理科，湖南 長沙 410015)

胸腔積液的原因復雜，常見的原因有結核、感染、腫瘤等[1-2]。常規的診斷方法是細胞學涂片，但是該方法存在腫瘤細胞與增生的間皮細胞不易鑒別的問題，部分病例也會因含血液成分較多而有診斷意義的細胞量少而難以診斷，并且無法判斷組織來源。本研究采用胸腔積液沉渣做細胞塊，并應用免疫組化等方法進行檢測，探討細胞塊結合免疫組化技術在惡性胸腔積液原發疾病肺癌的病理分型診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年1月至2018年6月我院病理科歸檔的確診的惡性胸腔積液的具有常規細胞學涂片和細胞塊資料的患者50例，其中男29例，女21例；年齡48～80歲，中位年齡64歲；原發腫瘤肺癌的組織學分型：腺癌30例，鱗癌12例，小細胞癌8例。所有病理資料均經高年資病理科醫師復核。

1.2 細胞學涂片將標本靜置6～12 h，移去上清液，取50 mL入試管內離心，2 000 r·min-1離心5 min后，棄去上清液，將底部約0.5 mL細胞液混勻，均勻涂于載玻片上，然后體積分數95%乙醇固定10～30 min，然后進行HE染色。

1.3 細胞塊的制作將胸腔積液放入50 mL的離心管中，2 500 r·min-1離心10 min，反復數次離心留取底部沉渣部分，移去上清液并加入質量分數4%中性多聚甲醛固定液離心靜置1 h，然后取沉淀物放入包埋盒內常規脫水包埋，4 μm切片，然后進行HE染色。

1.4 免疫組化染色將50例惡性胸腔積液細胞塊切片進行免疫免疫組化分析。本實驗的抗體及DAB顯色試劑均購自廣州深達生物技術有限公司。實驗采用免疫組化染色方法，操作過程嚴格按照說明書進行。細胞蠟塊切4 μm切片，常規烤片1 h脫蠟至水，過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，微波抗原修復，加入一抗4 ℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復染，PBS代替一抗作陰性對照。

1.5 結果判定免疫組化的結果：癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)、細胞角蛋白7(Cell Keratin 7，CK7)、天冬氨酸蛋白酶A(NapsinA)、淋巴細胞抗原(lymphocyte antigen，CD56)、嗜鉻素A(chromogranin A，CgA)、細胞角蛋白5/6(cytokeratin，CK5/6)陽性表達為細胞質和細胞膜出現陽性顆粒，甲狀腺轉錄因子-1(Thyroid transcription factor,TTF-1)、腎母細胞瘤基因(Nephroblastoma gene,WT-1)、P63陽性表達為細胞核出現陽性顆粒。

1.6 統計學處理采用SPSS 13.0進行統計學處理，計數資料用百分數表示，比較用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

腺癌中CEA陽性表達率80.00%、CK7為86.66%、NapsinA為90.00%、CD56為0.00%、CgA為10.00%、CK5/6為0.00%、TTF-1為100.00%、WT-1為10.00%、P63為16.66%；鱗癌中CEA陽性表達率25.00%、CK7為16.66%、NapsinA為0.00%、CD56為0.00%、CgA為16.66%、CK5/6為100.00%、TTF-1為8.33%、WT-1為16.66%、P63為100.00%；小細胞癌中CEA陽性表達率25.00%、CK7為12.50%、NapsinA為0.00%、CD56為100.00%、CgA為100.00%、CK5/6為0.00%、TTF-1為87.50%、WT-1為12.50%、P63為0.00%。見表1。

表1 不同組織類型肺癌惡性胸腔積液細胞塊中各指標的表達

3 討論

很多肺癌患者在未發現原發病灶之前主要表現為胸腔積液，如何能夠明確胸腔積液的性質，在明確性質后如何對肺癌進行組織學分型具有重大意義。美國國立綜合癌癥網絡指南對非小細胞肺癌的治療方案也根據病理分型而制定[3]。

本實驗采用的是胸腔積液離心制作細胞塊的方法，此方法相對于傳統涂片更具有優勢。傳統的涂片檢查方法是將標本靜置后進行直接細胞學涂片，查找具有診斷意義的細胞，但是這種方法送檢標本細胞密度低且混有紅細胞及炎性滲出物等造成細胞涂片厚度不均勻，細胞多層重疊，容易造成惡性腫瘤的漏檢[4]。做成細胞塊連續切片能夠較好的保留組織學結構，如腺管、腺泡、乳頭結構等[5-6]，且細胞塊為將來的免疫組化及基因檢測提供了較好的組織基礎和可操作性，從本實驗的胸腔積液細胞塊HE切片中可以看出腺癌很多時候可以看到腺管狀、乳頭狀結構，鱗癌也可以看到類似組織學的結構特點，小細胞癌可以看到擠壓變形的腫瘤細胞，當然這種HE切片的形態學觀察依然有些主觀，為了更精準分型，以滿足臨床上制定治療方案的需求，我們在此基礎上進行了免疫組化檢查，采用CEA、CK7、NapsinA、CD56、CgA、CK5/6、TTF-1、WT-1、P63等抗體進行檢測并探討其診斷的價值。結果顯示，腺癌中陽性率較高的抗體是TTF-1、CK7、NapsinA及CEA，TTF-1是一種相對分子質量38 000～40 000的核蛋白，在胎兒肺組織及成人的Ⅱ型肺泡上皮中存在，大多數肺腺癌、肺小細胞癌免疫組化顯示TTF-1陽性，而在肺鱗癌中陰性[6]。本研究顯示不同病理類型的肺癌中，腺癌中TTF-1陽性率100.00%，與文獻相符。NapsinA是一種胃酶樣天門冬氨酸蛋白酶，是肺腺癌的一種新標志物[7]，本研究結果顯示，NapsinA陽性率90.00%,而在鱗癌和小細胞癌中均是陰性，說明其敏感性和特異性均較好，是一種好的腺癌標志物。本研究結果還顯示CK7、CEA在腺癌中的表達較好，特別是CK7在腺癌中表達高，鱗癌及小細胞癌表達低，也是具有較高的診斷應用價值。鱗癌中陽性率較高的抗體是CK5/6和P63，p63作為鱗癌的標記物，敏感性極高且陽性定位于細胞核，CK5/6陽性定位于細胞漿和細胞膜，本研究結果顯示p63和CK5/6在鱗癌中陽性率為100.00%，且CK5/6在腺癌和小細胞中均未見表達，可見其敏感性和特異性均較高。小細胞癌中陽性率較高的抗體是CD56和CgA。肺神經內分泌腫瘤推薦的免疫組化標志物為CgA、CD56和Syn，我們的研究結果也證實，在胸腔積液細胞塊中的腫瘤細胞做免疫組化，小細胞癌中陽性率較高的也是CD56和CgA。

總之，通過我們的研究顯示，通過細胞塊結合免疫組化的方法可以明顯提高胸腔積液直接涂片法的準確率，在形態學傾向腺癌時可以選擇TTF-1、CK7、NapsinA及CEA; 傾向鱗癌時可以選擇P63和CK5/6，傾向小細胞癌時可以選擇CD56和CgA。這些抗體在敏感性核和特異性都具有很好的應用價值。而且通過細胞塊的制作也為基因檢測做了基礎，當然其對于基因檢測的應用價值還需要進一步檢測。