循環腫瘤DNA的臨床應用及展望

顧建建,陳大可,錢濱濱,顧小林

(江蘇省南通市通州區人民醫院 腫瘤科,江蘇 南通,226300)

癌癥嚴重威脅著人類的生命健康。中國人口眾多，醫療設備及醫護人員配置暫時無法與發達國家相比，大部分癌癥患者在確診時病情已經進展到中晚期，錯過了最佳的治療時機。隨著醫學水平的發展和提高，人們已經意識到有同樣病癥的患者對于同樣的治療手段的獲益各異。導致患者獲益效果不同的原因有多種，解決問題的關鍵在于以更精細的手段對癌癥進行分類，針對每個患者制定專屬的治療方案。“精準腫瘤學”的提出正是為了改善癌癥的診斷和治療現狀[1]。對基因組和其他分子進行分析，以獲知腫瘤的分子亞型，選擇對應的治療方法，并對預后進行預判。臨床上通常采用穿刺或者手術獲取腫瘤組織進行分子性能分析，但有時患者身體情況不允許采用此類方法獲得腫瘤組織，且此類方法也不適用于腫瘤的連續監測。因此，非侵襲方式的液體活檢更能滿足研究人員和精準醫學的需求。

液體活檢可以多次重復取樣，監測整個疾病進程，以及時發現耐藥、腫瘤轉移和復發，迅速調整治療方案。除此之外，也有多項研究項目利用液體活檢技術進行癌癥早期篩查。液體活檢最初是描述從血液樣本中獲取與組織活檢一樣診斷結果的檢測方法，后來擴展到以更多類型體液為檢測對象的技術，如尿液、腹水和胸腔積液[2-4]。外周血的分析對象主要包含循環腫瘤細胞(CTCs)、循環腫瘤DNA(ctDNA)、外泌體及循環RNA[5-8]。CTCs雖能提供完整的腫瘤細胞信息，但是不易捕獲;外泌體的提取及循環RNA的提取和保存具有一定的技術難度;ctDNA的捕獲和檢測是目前市場應用較多、流程較為成熟的液體活檢技術。本研究對ctDNA的特點、檢測技術、臨床應用以及技術發展前景等方面做簡要闡述與前瞻性探討。

1 ctDNA概要及優勢

1994年，研究[9]報道在胰腺癌患者的血液游離DNA中檢測到KRAS基因突變，這與在患者腫瘤中的KRAS突變相同，從而證實了血漿中的DNA突變片段是來源于腫瘤，也就形成了“循環腫瘤DNA(ctDNA)”這一術語，是癌癥的高度特異性標志物。最新研究[10-12]表明，ctDNA片段在90～150 bp的豐度有明顯提高，根據ctDNA在各長度區間分布而建立模型可有效區分腫瘤血液樣本和健康血液樣本，有目的地富集ctDNA能使液體活檢在更早期就檢測到癌癥。

壞死的腫瘤細胞、凋亡的腫瘤細胞、循環腫瘤細胞和腫瘤細胞外泌體都可能產生ctDNA,因此ctDNA來源于多個不同腫瘤區域或者多個病灶處,ctDNA分析結果可以提供腫瘤基因組的綜合描述，克服組織活檢的異質性，補充組織樣本中遺漏的突變[13-14]。ctDNA深度測序能發現只在部分細胞中出現的亞克隆突變，揭示具有獨特基因組特征的特定分子亞型[15-18]。CTCs或組織樣本想要獲得同類水平信息則需要多個樣本。ctDNA樣本易采集，且不局限于血液，尿液、胸腹水、腦脊液等體液都可以納入檢測范圍[19-22],其保存和運輸的研究成果也較為成熟，市面上已經有多個品牌的商業ctDNA保存管用于血液的采集保存，可長途運輸，操作手法簡單易行[23-25]。相較于RNA和外泌體,ctDNA的提取與保存操作難度低，很多實驗室和醫院都可以開展。

2 ctDNA檢測技術平臺

從單堿基突變到多基因突變檢測，有很多檢測方法可以靈活選擇。目前適用于ctDNA臨床檢測常用的技術平臺有ARMS-PCR平臺、數字PCR(dPCR)平臺和二代測序(NGS)技術平臺。

突變擴增系統(ARMS)是由Newton等[26]首先建立并用于檢測已知基因突變的方法。ARMS法可分為實時熒光定量PCR(qPCR)和巢式ARMS法電泳檢測[27-28]。根據PCR引物3′端堿基必須與模板DNA互補才能進行有效擴增的基本原理，依據已知突變位點設計引物，使3′端堿基分別與突變和野生型模板堿基進行互補、擴增，以區分突變模板和野生模板。ARMS法具有高特異性、高靈敏度以及耗時短、成本低、操作簡單等特點，其特異性的關鍵在于引物設計和PCR反應體系優化。

數字PCR概念誕生于1999年，包含PCR擴增和熒光信號分析兩個部分。樣品稀釋后分配到大量微小的反應單元中，每個單元包含1個或多個拷貝的目標分子，通過PCR反應體系對目標分子進行擴增，然后對每個反應單元的熒光信號進行采集。考慮到有些反應單位元可能會包含2個或2個以上的目標分子，分析軟件會應用泊松概率分布公式進行計算。不同于實時熒光定量PCR,數字PCR無需參照，可以同時實現相對定量和絕對定量，檢測靈敏度達到0.001%～0.01%[29-31]。根據反應單元類型不同，數字PCR可分為3類:微反應室數字PCR,借助高通量自動上樣設備實現快速精確取樣;微流控芯片數字PCR，含有數千個超高密度親疏水微孔芯片;微滴式數字PCR，將含有目標分子的樣品分成上千萬個納升級的油包水微滴，再對每個微滴進行擴增和熒光信號采集。由于數字PCR生成微滴內的模板數必須服從泊松分布，所以樣本濃度需要控制在一定范圍內。

ARMS和數字PCR只能針對已知突變位點設計引物進行檢測，且一次檢測的位點數有限。若需一次性地對多基因區域或未知突變進行檢測，則要借助下一代測序技術(NGS)。ctDNA豐富較高時可選擇全面的非特異性檢測，如全基因組測序(WGS)、全甲基化測序、血漿全基因組測序和全外顯子測序等。但大部分樣本獲得的ctDNA豐度較低，需要特異性富集。NGS的富集技術又分為靶向擴增子測序和目標序列捕獲測序[32-33]。靶向擴增子技術是針對目的基因設計數對PCR引物，利用多重PCR擴增富集。目標序列捕獲測序技術是針對目的基因設計探針，通過雜交捕獲的方法富集再進行PCR擴增。NGS通量高，一次運行可對多個樣本、多個基因區域、多種變異進行深度測序，檢測靈敏度能達到0.01%～0.5%,對于腫瘤診斷、治療和監測具有重大意義[34-36]。相比于PCR,NGS技術和數據處理較為復雜，實驗室水平間差異較大，其檢測流程暫未標準化。

3 ctDNA在腫瘤臨床方面的應用

ctDNA樣本可多次重復獲得決定了它可以貫穿疾病管理全周期，在腫瘤早篩、腫瘤診斷、用藥指導、耐藥監測、腫瘤轉移和復發監測等各個領域發揮不同的作用。

疾病的發生、發展需要一個過程，腫瘤亦是如此。中國醫療資源本就不均衡，沒有針對性的體檢往往無法在早期發現腫瘤，而目前常用的早篩技術(如腸鏡、胃鏡)，因體驗感不佳而導致受檢者依從性差。若能在癌癥早期或癌癥轉移之前確診，可以提高腫瘤治愈率，改善患者生存狀態。有研究[37-38]表明，能在患者癌癥確診2年前的唾液和血漿樣本中檢測到突變，華大基因也報道在NIPT檢測中有發現一些孕婦的血漿樣本含有異常變異并最后確診為癌癥，說明ctDNA在無創腫瘤早期診斷中的發展潛力。市面上現有的比較成熟的商業ctDNA腫瘤早篩試劑盒為Epigenomics公司的Septin9基因甲基化檢測試劑盒、北京博爾誠的Septin9基因甲基化檢測試劑盒和蘇州為真的人Septin9基因甲基化檢測試劑盒，就是基于臨床篩查實驗證明Septin9基因甲基化是結腸直腸癌早期發生、發展中的特異性分子標志物，主要用于大腸癌篩查。《中國早期結直腸癌篩查及內鏡診治指南》[39]也指出，中國一項大規模臨床試驗發現血漿Septin9基因甲基化檢測診斷結直腸癌的敏感度和特異性分為74.8% 和87.4%,高于同期進行的免疫化學糞便潛血試驗檢測。聯合ctDNA液體活檢和甲基化檢測技術還可以用于確定腫瘤原發病灶，以ctDNA甲基化的CpG島作為特定的檢測標簽，通過與各器官組織細胞DNA甲基化進行比對，快速檢測腫瘤細胞并確定腫瘤在體內的生長位置，為早期干預提供參考信息。

組織活檢是腫瘤診斷的金標準，但并不是所有患者的情況都允許進行組織活檢。如果無法進行組織活檢采集，醫生可通過ctDNA檢測對腫瘤進行分子分型診斷，依據結果分析而確定治療方案。對于晚期肺癌患者來說，表皮生長因子受體(EGFR)突變可能意味著患者能從酪氨酸激酶抑制劑中獲益，如吉非替尼、埃羅替尼等。ctDNA還可以用于選擇免疫治療方案,2018年一項研究[40]顯示，血液腫瘤突變負荷高(bTMB-H)的患者使用免疫治療比其他患者有更長的無進展生存時間(PFS)和總生存期(OS),該研究還發現同一個患者的組織TMB(tTMB)與bTMB呈顯著正相關。2019年肺癌NCCN指南將TMB檢測列為2A類推薦，以此指導免疫治療方案。另外，液體活檢可多次重復取樣的特點代表它在疾病監測、用藥監測及預后預測領域的廣闊發展空間。已有研究[41-42]發現在非小細胞肺癌和高級別漿液性卵巢癌中腫瘤體積和ctDNA突變等位基因頻率呈線性關系，通過ctDNA突變頻率獲知腫瘤大小信息，從而反映出疾病的發展狀態和對治療方案的反應。在一項肺癌研究項目[43]中，等體積血漿提取出的ctDNA濃度與肺癌患者的代謝腫瘤體積有很高的相關性。ctDNA豐度還可以評估免疫治療療效，對接受免疫治療的28例晚期非小細胞肺癌患者進行檢測，結果顯示出現ctDNA緩解(將ctDNA突變豐度自基線下降50%定義為ctDNA緩解)的患者更容易臨床獲益[44]。此外，還可利用ctDNA檢測結果建立分析模型，預測患者體內有無腫瘤殘留、復發，對不同風險的患者進行更為個體化的治療[45]。

4 ctDNA檢測試劑盒獲批現狀

凱杰與阿斯利康合作開發的Therascreen EGFR Plasma RGQ PCR試劑盒是全球首個以“液體活檢”進行登記的伴隨診斷試劑盒，于2015年1月在歐洲推出。目前全球僅有6款ctDNA檢測試劑盒獲批，中國國家食品藥品監督管理總局批準的3款ctDNA檢測試劑都僅用于大腸癌早篩，暫時沒有伴隨診斷試劑。6款試劑所用的檢測方法都是基于PCR，暫無NGS技術平臺和dPCR技術平臺。FDA和CFDA現批準的基于NGS技術平臺的多基因檢測試劑盒針對的樣本類型都是FFPE。這預示體外診斷試劑的市場對液體活檢技術的需求，以及研究機構應加強液體活檢技術的臨床驗證。6款ctDNA檢測試劑盒詳情見表1。

表1 ctDNA檢測試劑獲批詳情

5 ctDNA臨床應用展望

ctDNA在臨床應用中顯示出巨大潛力。健康人群的血漿游離DNA濃度為1～10 ng/mL,理論上晚期癌癥患者的血漿游離DNA濃度會增大，但個體差異會導致有些患者的游離DNA濃度很低，血漿中ctDNA的檢出與腫瘤負荷相關聯[41,46]。采用分子條形碼標記被測序的DNA片段可以提高測序的準確性;或是在提取時富集特定大小片段的cfDNA，以提高ctDNA初始比例;或是檢測多種基因突變，聯合確定陽性樣本的cut-off值[32,36,41,47]。目前商業檢測機構都側重于開發基于NGS對腫瘤基因組測序的方法，但更精準的腫瘤類型判讀應該基于多個檢測方法結果綜合分析的基礎上，例如從DNA、RNA、蛋白和表觀遺傳學對腫瘤進行基因組學、轉錄組學、表觀基因組學、蛋白質組學和代謝組學等多方面的綜合分析[48-52]。這些多參數結果分析可以更深入地了解分子突變在腫瘤分型中扮演的角色和功能，有助于發現新的腫瘤亞型和研發靶標新藥。面對海量的測序數據庫，可引入機器學習，探索數據中隱藏的信息寶藏[53]。

目前ctDNA臨床應用最大的挑戰之一就是檢測結果的一致性和臨床的有效性還未得到完全確認。有研究[54]使用不同的ctDNA檢測方法對同一批樣本進行檢測，34個受檢樣本中僅有9個樣本結果完全一致。另有研究人員比對了Guardant 360和PlasmsSELECT對40例胰腺癌患者的cfDNA檢測結果,25例檢出有基因變化的僅3例結果完全一致。商業檢測機構和研究人員需要聯合起來進行多中心研究，使用足夠大的患者群和樣本數據來確認ctDNA檢測的分析效度和臨床有效性。