輸尿管熱損傷后TGF-β亞型及α-SMA表達的實驗研究▲

劉 昕 孫毅海* 唐 深 陶衛琦 李少紅 黃才勝 黃超斌 黃慧寧 謝 陽

(1 廣西南寧市第二人民醫院泌尿外科，南寧市 530031；2 廣西醫科大學基礎醫學院，南寧市 530021)

隨著泌尿外科腔內技術的發展，臨床上越來越多的患者接受腔鏡手術治療，包括輸尿管鏡、鈥激光技術。隨之而來的醫源性輸尿管損傷也逐漸增多，輸尿管損傷后出現的輸尿管狹窄是泌尿外科較為棘手的臨床問題之一。輸尿管狹窄的形成以及治療后狹窄復發，也成為泌尿外科醫師亟待解決的困擾[1]。本實驗采用定量反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術測定正常兔輸尿管以及鈥激光損傷后兔輸尿管的瘢痕生成相關的轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)亞型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達水平，以探討鈥激光輸尿管熱損傷導致瘢痕狹窄的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 以10只成年新西蘭二級大白兔為實驗對象，重量2.5～3.0 kg，年齡4～6個月。RNAlater、TRIzol等RNA保存和抽提試劑購自Life Technologies公司，引物合成、熒光定量PCR等分子生物學試劑購自Takara公司。主要儀器有島津Biospec-nano微量蛋白核酸檢測儀、羅氏480定量PCR儀、Bio-Rad水平電泳系統、Bio-Rad梯度PCR儀、ProteinSimple凝膠成像系統。

1.2 方法 丙泊酚1.5 mg·min-1·kg-1經兔耳緣靜脈微泵注入，持續靜脈麻醉。麻醉后取俯臥位，右側背部術野備皮，用碘伏消毒術野皮膚,鋪無菌手術巾，取右側腰部縱向切口，長約5 cm，依次切開皮膚、皮下，鈍性分離肌肉層，從腹膜后游離右腎盂及輸尿管。7號注射器針頭穿刺證實有尿液流出后，經針頭置入200 μm鈥激光光纖，鈥激光功率設置為10 W，對輸尿管壁環形燒灼。隨后退出針頭及光纖，縫合肌層及皮膚切口。術中靜脈注射青霉素80萬單位。術后飼養3周，每天用碘伏清洗傷口1次，直至傷口愈合。皮膚縫線無須拆除，傷口愈合后可自行脫落，術后1只因傷口漏尿致感染死亡，1只因術中麻醉過深而死亡。

1.3 標本采集及檢測 飼養3周后處死，經腹切口取出患側(鈥激光損傷組)及健側(對照組)腎臟和輸尿管，行RT-PCR定量檢測TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3及α-SMA水平。檢測步驟：(1)合成引物；(2)利用Trizol法抽提總RNA，電泳法檢測RNA完整性，測量RNA的OD260、OD280吸光度值；(3)逆轉錄合成cDNA；(4)熒光定量PCR引物測試；(5)SYBR Green法實時定量PCR檢測各基因表達水平。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt方法分析比較基因的表達差異。ΔΔCt=鈥激光損傷組(Ct目的基因-Ct內參基因)-對照組(Ct目的基因-Ct內參基因)。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 瓊脂糖電泳 各樣本總RNA的3條電泳帶清晰，28S rRNA較18S rRNA約高出一倍，提示組織樣本未發生降解，取材良好；且各樣本紫外分光光度法測試核酸OD260/280吸光度值比值均在1.8～2.1。上述實驗結果顯示各樣本抽提獲取的總RNA完整性好，符合后續的熒光定量PCR檢測各基因mRNA表達水平的要求。如圖1。

M：DNA marker(Takara DL2000)1：對照組 2：鈥激光損傷組圖1 兔輸尿管RNA瓊脂糖電泳圖

2.2 熒光定量PCR引物溶解曲線測試 各引物的溶解曲線均為單一峰，引物擴增特異性等符合熒光定量PCR實驗要求。見圖2。

TGF-β1 TGF-β2

TGF-β3 α-SMA

2.3 定量PCR檢測結果 鈥激光損傷組TGF-β1、TGF-β2、α-SMA表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)，且α-SMA表達增幅比TGF-β1、TGF-β2更高。而兩組TGF-β3表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兔輸尿管相關基因熒光定量PCR檢測結果

3 討 論

輸尿管狹窄是泌尿外科較為棘手的問題之一，嚴重的狹窄可導致患側上尿路梗阻，進而使腎功能受損甚至喪失。大多數輸尿管狹窄為后天性狹窄，往往是由于輸尿管損傷所致。臨床上常見的輸尿管損傷為輸尿管結石損傷、盆腔手術損傷、輸尿管腔內手術損傷、腫瘤放療損傷等。隨著泌尿外科腔內技術的發展及鈥激光技術的應用，輸尿管腔內操作或手術導致的輸尿管損傷逐漸增多，因此，輸尿管腔內損傷并狹窄形成機制的研究，以及探討干預狹窄形成的方法將對臨床工作具有重要的指導意義。

近年來，隨著鈥激光在泌尿外科中應用的普及，其已經成為泌尿外科治療的首選激光。鈥激光以其對軟組織精確的消融、氣化、切割、凝固、止血的作用，在臨床各科得到了廣泛的應用，尤其在泌尿外科的經腔道治療中具有不可替代的優勢，目前多用于泌尿系統結石碎石、腫瘤消融、前列腺切除、輸尿管及尿道狹窄瘢痕切開等手術[2]。但是由于激光的光熱效應，對組織可造成熱損傷，在應用于輸尿管結石的碎石過程中，若操作不慎，可對輸尿管黏膜、肌層甚至漿膜層造成損傷。損傷后輸尿管組織在自我修復過程中形成的增生性瘢痕組織，是輸尿管損傷性狹窄的病理基礎。

研究表明，TGF-β在成纖維細胞中的高表達，是與瘢痕形成關系最為密切的細胞因子[3]。類似的研究發現，TGF-β1、α-SMA與膽道損傷后瘢痕增生、狹窄形成有明確的關系[4]。TGF-β分為3個亞型，分別為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，它們在體內具有不同的功能以維持相互之間的機體平衡，這種平衡的失調將導致組織器官纖維化。而α-SMA是肌成纖維細胞的標志性蛋白，是瘢痕收縮的物質基礎。本實驗結果中，輸尿管鈥激光損傷后，瘢痕形成的輸尿管平滑肌中TGF-β1、TGF-β2、α-SMA表達較正常輸尿管明顯升高(P<0.05)，提示熱損傷增加了輸尿管平滑肌成纖維細胞中TGF-β1、TGF-β2、α-SMA的表達，從而導致平滑肌瘢痕形成及輸尿管狹窄。在體外培養的瘢痕成纖維細胞中，TGF-β1、TGF-β2可促進瘢痕成纖維細胞增殖，增強纖維蛋白和膠原分泌。有研究發現，使用激光、雙氫青蒿素等物理或化學方法降低TGF-β1的分泌量可以抑制瘢痕成纖維細胞的形成[5-6]。

對于輸尿管熱損傷后TGF-β3表達無明顯變化的結果，可能意味著TGF-β3不參與瘢痕形成過程。相關研究表明，TGF-β3可能有拮抗TGF-β1、TGF-β2及抑制瘢痕形成的作用[7]。輸尿管損傷后α-SMA的高表達，與TGF-β1、TGF-β2的表達有關。研究表明TGF-β1、TGF-β2對α-SMA的表達有促進作用[8]。

通過對輸尿管鈥激光損傷后相關瘢痕因子的動物實驗結果表明，TGF-β1、TGF-β2、α-SMA的高表達與鈥激光輸尿管損傷狹窄發生密切相關。因此，在輸尿管腔內鈥激光操作的過程中應避免或減少鈥激光對輸尿管的損傷，或者通過調控TGF-β亞型及α-SMA的表達減少輸尿管狹窄的發生。