川芎、冰片配伍對腦缺血大鼠海馬和下丘腦神經(jīng)元的保護作用

喻 斌，阮 鳴，許 立，劉圣金，許惠琴，沈祥春

(1. 南京中醫(yī)藥大學部省共建中藥藥理實驗室，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023；2. 南京曉莊學院食品科學學院，江蘇 南京 211117；3. 貴州醫(yī)科大學天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

根據(jù)國家心血管病中心發(fā)布的《中國心血管病報告2016》，我國居民的首要死因為腦血管疾病的省份有27個。此外，與1990年比較，缺血性腦卒中的死亡率上升了28.8%[1]。顯然，腦血管疾病的防治目前仍然是醫(yī)學研究的熱點。神經(jīng)元興奮毒是腦缺血/再灌注后的后繼反應(yīng)，表現(xiàn)為興奮性氨基酸觸發(fā)以鈣超載為代表的損傷反應(yīng)，后者又反過來進一步加重神經(jīng)損傷，形成惡性循環(huán)。

川芎和冰片配伍來自宋《圣濟總錄》卷十五“清神散”化裁而來。后者由川芎、莎草根、石膏、冰片4味藥組成，主治腦中風、頭痛等癥。近年來臨床研究表明，川芎-冰片配伍對腦缺血具有明顯治療作用[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，川芎的活性成分川芎嗪和冰片配伍后，對全腦缺血/再灌注(global cerebral ischemia reperfusion, GCIR)損傷大鼠的皮層、海馬、下丘腦和紋狀體均表現(xiàn)較好的改善作用[3]，并且這一改善作用伴隨著冰片劑量的差異，還表現(xiàn)出一定的腦區(qū)特異性[4]。在進一步的機制研究中，我們發(fā)現(xiàn)川芎嗪和冰片配伍抗腦缺血的作用機制與減少神經(jīng)元凋亡和促進自噬形成有關(guān)[5-6]。考慮到川芎嗪為川芎的活性成分之一，川芎和冰片的配伍又涉及哪些機制呢？目前還未見研究報道?；谝陨媳尘埃覀冮_展本次研究。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑川芎提取物的制備：川芎藥材購于江蘇省中醫(yī)院，粉碎，過40目篩，加入20倍體積的50%乙醇，回流提取2 h，濾過，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，殘渣用生理鹽水(normal saline，NS)溶解，濃度為2.0 kg(生藥量)·L-1。冰片購于北京同仁堂藥店，北京三和藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號77820501。以上藥材經(jīng)本校中藥鑒定教研室劉圣金副教授鑒定為正品。冰片溶液的配制方法為：取3.2 g，磨碎，加丙二醇溶解，加聚乙二醇400和吐溫-80，再加水至100 mL，終濃度為32 g(生藥量)·L-1。人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)，配方為(mmol·L-1)：KCl 2.5、NaCl 125、MgCl2·6 H2O 1.18、CaCl2·2 H2O 1.26、NaH2PO4·H2O 0.5、Na2HPO4·2 H2O 5。甘氨酸(glycine，Gly)、谷氨酸(glutamate，Glu)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)標準品，中國藥品生物制品鑒定研究院，批號分別為20160817、20160115、20141211；Fluo-3/AM 探針(批號10F0402)，美國Biotium公司；TUNEL凋亡測試盒(批號10768100)，美國羅氏公司。

1.2 實驗動物SPF級SD大鼠，♂，體質(zhì)量(200±20)g，購于上海杰思捷實驗動物有限公司，許可證號：SYXK(滬)2013-0006。

1.3 儀器微透析系統(tǒng)：RWD302型雙通道微透析注射泵(深圳瑞沃德)，配備A-Z-X-Y安全性腦用探針(內(nèi)徑/外徑200/220 μm，截留分子量50 ku，日本Eicom公司)；Agilent 7890A/5975C氣-質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫)，配有Agilent G4513A自動進樣器、Agilent HP-5MS毛細管柱、Agilent色譜工作站和NIST2008質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫；TCS-SP5型激光共聚焦顯微系統(tǒng)(德國萊卡)；IX71熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.4 方法

1.4.1GCIR模型的復(fù)制及分組 按照文獻方法進行4-動脈阻斷法復(fù)制GCIR模型。麻醉大鼠，頸正中切口并分離雙側(cè)頸總動脈。頸背部正中切口，分離肌層，暴露第1頸椎橫突翼孔，直視下電凝其下通過的椎動脈，使雙側(cè)椎動脈永久閉塞。術(shù)后大鼠縫皮回籠。24 h后用無創(chuàng)小動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，造成全腦缺血。缺血20 min，松開動脈夾再灌注。按照Pulsinelli等[7]報道確定模型成功標準，將造模成功的大鼠分為4組：模型組、川芎組(1.0 g·kg-1)、冰片組(0.16 g·kg-1)、川冰組(1.0 g·kg-1川芎+0.16 g·kg-1冰片)，另制備假手術(shù)組。模型組和假手術(shù)組給予NS。連續(xù)灌胃給藥7 d后進行后續(xù)檢測。

1.4.2Glu、Gly和GABA的測定

1.4.2.1腦微透析液的收集 大鼠麻醉后，用腦立體定位儀固定，剔除大鼠腦部的毛發(fā)，剪開皮膚，剝離皮下組織至腦殼，按照海馬和下丘腦的腦區(qū)坐標(海馬AP -3.8 mm, ML +2.0 mm, DV -3.0 mm，下丘腦AP -2.0 mm, ML +0.4 mm, DV -8.2 mm)，用牙科鉆打穿腦頂位置的投射點，植入微透析探針。探針灌注ACSF，在整個實驗期間保持2.0 μL/min的流速。整個系統(tǒng)穩(wěn)定1.5 h后，兩個腦區(qū)同時進行微透析，透析30 min后，透析液于-80 ℃存儲。微透析完畢后，取腦于福爾馬林固定，組織學檢查以確定探針位置是否正確，如不正確，則該樣本不計。

1.4.2.2樣本預(yù)處理 取樣本50 μL于1.5 mL離心管中，加入350 μL(1 ∶50)稀鹽酸，渦旋振蕩30 s，上清液用真空離心濃縮儀濃縮。加入60 μL甲氧基溶液(15 g·L-1，溶于吡啶)渦旋振蕩30 s，在37 ℃條件下反應(yīng)2.5 h，最后加入60 μL BSTFA試劑(含1%三甲基氯硅烷)，37 ℃條件下反應(yīng)3 h。經(jīng)過以上的反應(yīng)，用GC-MS聯(lián)用儀進行檢測。根據(jù)Glu、Gly和GABA的標準曲線進行定量。

1.4.2.3色譜條件 色譜柱HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；分流進樣，進樣量1 μL，分流比20 ∶1。進樣口溫度280 ℃，離子源溫度250 ℃，接口溫度150 ℃。程序升溫起始溫度70 ℃；保持2 min，以10 ℃·min-1升至300 ℃，保持5 min?？傔\行時間為30 min， 載氣為氦氣，載氣流速1 mL·min-1。MS條件：倍增電壓1 787 V，電子轟擊離子(EI)源，電子能量70 eV，掃描方式：全掃描，檢測質(zhì)荷比范圍50～300 m/z。

1.4.3腦內(nèi)鈣離子濃度的測定 參照文獻方法，大鼠斷頭，迅速取腦，浸入0 ℃預(yù)先飽和混合氧氣(95% O2+5% CO2)的ACSF。分離出海馬和下丘腦組織后，經(jīng)振動切片機制成400 μm厚的腦片，移入ACSF中，室溫下恢復(fù)孵育60 min后，在37 ℃含F(xiàn)luo-3/AM(10 μmol·L-1)的ACSF中再孵育30 min，選擇在3～5 min保持熒光值穩(wěn)定的神經(jīng)元進行監(jiān)測，檢測時使用雙激發(fā)單發(fā)射的方式進行掃描，雙激發(fā)波長分別為340 nm和380 nm，發(fā)射波長為505 nm，細胞內(nèi)游離Ca2+濃度由2種波長熒光強度的比值(F340/F380)反映。

1.4.4凋亡率的測定 取腦組織，分離出海馬和下丘腦后，于4%多聚甲醛溶液固定，包埋、切片，按照試劑說明書方法進行染色，封片、干燥后，在光學顯微鏡下觀察。凋亡細胞以細胞核呈棕黃色著色為陽性細胞。在高倍鏡下計數(shù)200個細胞中陽性細胞所占百分率。

1.4.5電鏡檢測 取海馬和下丘腦組織，于2.5%戊二醛固定后，經(jīng)0.1 mol·L-1磷酸漂洗、1%鋨酸固定，脫水、包埋、固化、超薄切片后，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察、攝片。

2 結(jié)果

2.1 川芎和冰片配伍對GCIR大鼠海馬和下丘腦組織中Glu、Gly和GABA含量的影響GC-MS檢測的代表性總離子流圖見Fig 1，可見各成分之間分離完全，無干擾。各氨基酸成分的線性回歸方程見Tab 1。結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬和下丘腦兩個腦區(qū)興奮性氨基酸Glu水平均明顯升高，同時抑制性氨基酸Gly和GABA均明顯降低(P<0.01)，提示興奮性毒的發(fā)生。與模型組比較，川芎可明顯升高這兩個腦區(qū)的GABA水平(P<0.05，P<0.01)，但對Gly和Glu未見明顯影響。而冰片僅降低這兩個腦區(qū)組織的Glu，對GABA和Gly無明顯改善。當它們配伍應(yīng)用后，除了可改善海馬和下丘腦的Glu和GABA含量，還可進一步升高下丘腦Gly含量(P<0.05，P<0.01)，顯示較好的協(xié)同效應(yīng)(Tab 2)。

Fig 1 Representative total ion chromatogram of Glu, Gly and GABA in hippocampus(A) and hypothalamus(B) by GC-MS

Tab 1 Linear equation and range of Gly, GABA and Glu

2.2 川芎和冰片配伍對GCIR大鼠海馬和下丘腦區(qū)域神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度的影響如Fig 2所示，與假手術(shù)組比較，GCIR處理后可見大鼠海馬和下丘腦腦片細胞中鈣離子濃度明顯升高(P<0.01)，提示鈣超載已發(fā)生。與模型組比較，川芎和冰片單一用藥治療均可明顯降低兩個腦區(qū)神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子濃度(P<0.05)，而它們聯(lián)合治療效果更佳(P<0.01)，進一步體現(xiàn)了它們配伍應(yīng)用的優(yōu)勢。

2.3 川芎和冰片配伍對GCIR大鼠海馬和下丘腦神經(jīng)元凋亡率的影響如Fig 3所示，凋亡陽性細胞可見細胞核的棕黃色染色。GCIR處理后可見大量的凋亡神經(jīng)細胞在大鼠海馬和下丘腦組織出現(xiàn)(P<0.01)。川芎單一用藥治療或聯(lián)合冰片治療可明顯降低兩個腦區(qū)的神經(jīng)元凋亡指數(shù)(P<0.01)，但單一冰片治療卻未見明顯改善(P>0.05)。

2.4 川芎和冰片配伍對GCIR大鼠海馬和下丘腦區(qū)域神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響Fig 4的透射電鏡結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠海馬和下丘腦區(qū)的神經(jīng)細胞的細胞膜和核膜完整，線粒體無腫脹，內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)可見，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完整光滑。模型組大鼠已出現(xiàn)線粒體腫脹，內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)消失，甚至空泡化，胞質(zhì)內(nèi)其他細胞器溶解消失，核膜和胞膜的連續(xù)性被破壞，核膜溶解。給予川芎和冰片治療后，可見以上結(jié)構(gòu)有所改善，細胞器溶解減少，尤其是線粒體結(jié)構(gòu)空泡化減少，兩者的合用改善效果更加明顯。

3 討論

自1969年Olney提出興奮毒性概念以來，至今一系列研究已證明，興奮性氨基酸(excitative amino acid，EAA)作為后繼級聯(lián)反應(yīng)的觸發(fā)事件，在腦缺血/再灌注引起的神經(jīng)元死亡中起到重要的作用。大腦的EAA以谷氨酸為代表，含量也最高，占游離氨基酸的40%，其與腦缺血的關(guān)系也最為明確。抑制性氨基酸以GABA和Gly為代表。這兩種神經(jīng)氨基酸的比例在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮/抑制平衡中具有重要作用。缺血性腦損傷首先引起腦組織能量耗竭，導(dǎo)致Na+-K+-ATP酶活性降低，引起胞內(nèi)Na+濃度增加，后者除了可引起神經(jīng)細胞水腫外，還可抑制Glu的再攝取，導(dǎo)致胞外Glu濃度大幅增加，然后通過激活NMDA受體門控Ca2+通道，增加胞內(nèi)Ca2+濃度，后者又進一步激動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ryanodine受體2，促進胞內(nèi)Ca2+釋放，導(dǎo)致細胞內(nèi)游離Ca2+超載。而Ca2+超載除了引發(fā)基于NO、磷脂酶C、磷脂酶A2、氧自由基等途徑的神經(jīng)元損傷外，還可通過上調(diào)p53基因及其下游基因Bax，下調(diào)Bcl-2基因和激活caspase-3通路，觸發(fā)凋亡通路，最終造成神經(jīng)元的進一步損傷。

Fig 2 Synergic effect of CR and BO on improving intracellular[Ca2+]i in hippocampus and hypothalamus of GCIR vs sham;*P<0.05,**P<0.01 vs model

##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

傳統(tǒng)醫(yī)學認為，腦缺血屬于腦卒中的范疇，瘀血閉阻腦脈是其基本病機，活血、化瘀、開竅、醒神作為第一治則。川芎及其活性成分川芎嗪對缺血性腦損傷的保護作用已被大家所普遍認可，并在臨床廣泛應(yīng)用。近年研究發(fā)現(xiàn)這一保護作用與它們抑制NF-κB，激活I(lǐng)κB，減少神經(jīng)元氧化損傷及凋亡密切相關(guān)[8]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，冰片的“引藥上行”功效與促進血腦屏障生理性開放，促進藥物入腦有關(guān)[9-11]。但大量研究證實，冰片自身作為“醒腦開竅”藥對腦缺血/再灌注機體也具有改善行為學異常，減少腦梗死面積，增強學習記憶能力的效應(yīng)，其機制可能與抑制腦內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)氧酶和脂氧酶活性，減少NF-κB表達，抑制TNF-α、IL-1等炎癥介質(zhì)形成有關(guān)[12-13]。黃萍等[14]發(fā)現(xiàn)，冰片與川芎配伍后，對腦缺血動物具有保護血管內(nèi)皮細胞功能、基膜的完整性，改善微循環(huán)，減輕腦水腫程度的作用，并且作用明顯優(yōu)于單用川芎或冰片，其作用機制可能與減少缺血腦組織中NO的生成，減輕NO介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用，提高自由基清除酶的活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。我們在前期研究中，針對皮層、海馬、紋狀體和下丘腦4個腦區(qū)分別進行了川芎、冰片的配伍研究，發(fā)現(xiàn)川芎與不同劑量的冰片配伍，在腦循環(huán)、組織學評分、炎癥因子、氧化應(yīng)激等指標的改善中具有明顯的腦區(qū)特異性，并發(fā)現(xiàn)當冰片劑量為0.16 g·kg-1時，對海馬和下丘腦改善作用最為明顯[15]。

Fig 4 Synergic effect of CR and BO on ultrastructures in hippocampus and hypothalamus of GCIR rats(×10 000)

本實驗觀察川芎和冰片配伍對GCIR大鼠海馬和下丘腦的保護作用，發(fā)現(xiàn)川芎僅升高這兩個腦區(qū)的GABA，冰片僅降低這兩個腦區(qū)組織的Glu。而配伍應(yīng)用還可進一步升高下丘腦Gly含量，表現(xiàn)較好的協(xié)同關(guān)系。川芎和冰片單用均可降低兩個腦區(qū)神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子濃度，緩解超微結(jié)構(gòu)的損傷性改變，而它們的聯(lián)合治療作用更加明顯。這些結(jié)果提示，川芎和冰片配伍可在緩解神經(jīng)元毒性、鈣超載和超微結(jié)構(gòu)異常方面表現(xiàn)較好的協(xié)同效應(yīng)。但在抗凋亡方面，川芎單用即可減少這兩個腦區(qū)的神經(jīng)元凋亡指數(shù)，與冰片配伍未見改善作用的進一步增強。