雙亞芐基哌啶RA190阻滯HL60細(xì)胞于G0/G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

鄭曉輝，徐淑娟，黃家福，林振興， 祝珊珊，許雅蘋，馬麗娟，黃黎月

(1. 廈門醫(yī)學(xué)院機(jī)能與臨床轉(zhuǎn)化福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361023；2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科,福建福州 350001；3. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液科，廣東 廣州 511436; 4. 廈門醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,福建 廈門 361023)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是具有明顯遺傳異質(zhì)性的臨床侵襲性疾病。靶向異常基因治療是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。黏附調(diào)節(jié)分子1(adhesion regulating molecule 1，ADRM1)亦被稱為 hRpnl3(human Rpn13)，是26S蛋白酶體亞單位19S調(diào)節(jié)顆粒上兩個主要泛素受體之一，決定26S蛋白酶體結(jié)構(gòu)不對稱性。該蛋白在多細(xì)胞真核生物內(nèi)高度保守，在生命過程中可能發(fā)揮重要功能。有研究表明[1-3]，ADRM1在肝癌、胃癌、急性白血病等多種惡性腫瘤中過表達(dá)，下調(diào)ADRM1蛋白水平可明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。因此，ADRM1可能成為腫瘤治療靶點(diǎn)。

雙亞芐基哌啶RA190是近幾年研究發(fā)現(xiàn)的ADRM1抑制劑，通過與ADRM1的半胱氨酸88共價結(jié)合，抑制蛋白酶功能[4]。本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測不同濃度RA190作用下HL60細(xì)胞活率，分析細(xì)胞周期與凋亡及ADRM1蛋白水平，以了解RA190在AML中作用機(jī)制，為AML治療采用靶向ADRM1策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人急性粒細(xì)胞白血病部分分化型細(xì)胞HL60為本實(shí)驗(yàn)室保存。RA190(MCE)；PI(KeyGEN Biotech)；Annexin V FLUOS Staining Kit(Roche)；Western blot抗體(CST公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Corning)；胎牛血清(Gemini)。流式細(xì)胞儀EPICSXL(BECKMAN COULTER)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 設(shè)不同濃度RA190(終濃度0.5、1、2、4 μmol·L-1)實(shí)驗(yàn)組和空白對照組，采用臺盼藍(lán)拒染法于細(xì)胞自動計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期與凋亡 設(shè)不同濃度RA190實(shí)驗(yàn)組(0.5、1 μmol·L-1)和空白對照組，按照PI及Annexin V FLUOS Staining Kit試劑盒說明書操作。

1.2.3Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，PBS洗2次，加入RIPA細(xì)胞裂解液(含1 mmol·L-1PMSF、1 mmol·L-1正釩酸鈉、10 mg·L-1抑肽酶)提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，取40 μg總蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。10% SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，分別用β-actin、ADRM1、Cyclin B1一抗與膜上的抗原結(jié)合，然后用HRP偶聯(lián)的二抗與其反應(yīng)，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測，經(jīng)壓片曝光后，顯影和定影。比較各組蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 RA190對HL60細(xì)胞增殖的影響隨RA190濃度提高，HL60細(xì)胞活率降低(Tab 1)，說明RA190抑制HL60細(xì)胞增殖，半抑制濃度(IC50)約為3.1 μmol·L-1。

Tab 1 Viability of HL60 cells treated with differentconcentrations of RA190 for 24

2.2 RA190阻滯HL60細(xì)胞于G0/G1期RA190作用下，HL60細(xì)胞G0/G1期比率比空白對照組明顯增加(P<0.05)，見Tab 2。

Tab 2 Cell cycle and apoptosis of HL60 treated with different concentrations of

*P<0.05vsRA190 0 μmol·L-1

2.3 RA190促進(jìn)HL60細(xì)胞凋亡Tab 2結(jié)果顯示，隨著RA190濃度提高，HL60細(xì)胞早期與晚期凋亡均增加(P<0.05)。

2.4 RA190對ADRM1蛋白水平影響由于RA190誘導(dǎo)HL60細(xì)胞G0/G1期阻滯，本實(shí)驗(yàn)檢測了Cyclin B1蛋白水平。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ADRM1與Cyclin B1蛋白表達(dá)均減少。

3 討論

研究表明[4-5]，雙亞芐基哌啶RA190與泛素受體ADRM1結(jié)合后，快速觸發(fā)多泛素蛋白累積，誘導(dǎo)對硼替佐米耐藥的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡，也抑制卵巢癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)中，隨RA190濃度提高，HL60細(xì)胞活率下降、凋亡增加、G1期停滯，說明RA190對HL60細(xì)胞具有明顯毒性；此時細(xì)胞內(nèi)ADRM1和Cyclin B1蛋白減少。這與預(yù)期及其他學(xué)者研究結(jié)果一致。

ADRM1募集UCH37形成ADRM1/UCH37復(fù)合物，介導(dǎo)NF-κB降解與活性，參與細(xì)胞周期和凋亡過程。UCH37通過影響B(tài)ax/Bcl-2比率和caspase-9、caspase-3酶活性，抑制細(xì)胞凋亡；NF-κB轉(zhuǎn)錄因子對絕大多數(shù)惡性腫瘤具有促癌作用。因此，ADRM1可能通過UCH37抑制HL60細(xì)胞凋亡，也可能通過NF-κB信號通路起作用。

腫瘤細(xì)胞增殖加速常伴隨細(xì)胞周期改變，而細(xì)胞周期受周期調(diào)控蛋白影響。哺乳動物細(xì)胞中，Cyclin B從G1期晚期開始表達(dá)并逐漸積累，到G2期后期達(dá)到最大值，并一直維持到M期中期后迅速降解。RA190作用下，細(xì)胞內(nèi)Cyclin B1蛋白表達(dá)減少，阻滯細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，其機(jī)制是RA190的直接作用，還是ADRM1表達(dá)減少導(dǎo)致？有待后續(xù)研究。