神經母細胞瘤抑瘤蛋白1在肺動脈高壓大鼠中的表達變化

孟劉坤，滕 曉，袁 雯，孟 健，李 君，劉曉艷

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 國家心血管病中心阜外醫院 心血管疾病國家重點實驗室，北京 100037；2. 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院醫學研究中心，北京 100020)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種由異源性疾病以不同發病機制引起的，以肺小動脈進行性重構和肺血管阻力持續增加為特征的臨床綜合征[1]，具有潛在致死性，是繼冠脈綜合征、高血壓之后最常見的心血管病綜合征。研究發現，肺動脈細胞組份重獲增殖潛能導致的肺血管持續性重構是PAH的主要病理改變，表現為無肌層肺小動脈肌化，肌性肺動脈中膜肌層增厚，特征性的肺小動脈新生內膜和叢狀病變的形成[2]。

先前的研究發現，神經母細胞瘤抑瘤蛋白1(neuroblastoma suppression of tumorigenicity 1，NBL1)在正常肺組織中表達水平最高，而其在肺組織發育及病理狀態下的作用至今未知[3-5]。腫瘤方面的研究發現，NBL1對腫瘤細胞的增殖具有重要的調節作用[6-9]，但NBL1對肺動脈細胞的影響至今未知。因此，我們推測NBL1或參與了PAH的肺血管重構。本實驗擬研究野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導的PAH大鼠肺組織和血漿中NBL1的水平及變化趨勢，為探討其在肺血管重構中的作用及作為PAH潛在的生物標志物奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SD大鼠40只，♂，體質量(200±10)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001，均在中國醫學科學院阜外醫院實驗動物中心飼養。

1.1.2試劑 MCT (Sigma公司)；TRIzol (Invitrogen公司)；AMV逆轉錄試劑盒、PCR引物(TaKaRa生物工程有限公司)；抗NBL1抗體(Proteintech公司)；抗p-Smad1/5/8抗體(Cell Signaling Technology公司)；抗Smad1/5/8抗體(Santa Cruz公司)；抗GAPDH抗體(Abmart公司)；二辛可酸蛋白定量試劑盒(Abcam公司, ab102536)；NBL1 ELISA檢測試劑盒(R&D公司, DY955)；Power SYBR green PCR mastermix (ABI公司)；重組人BMP-2、重組人BMP-4(R&D公司)。

1.1.3儀器 Inspria ASVP小動物呼吸機(Harvard Apparatus公司)；Powerlab 16/30生理記錄儀(AD Instruments公司)； 奧德賽紅外成像系統(LI-COR Biosciences)。

1.2 動物實驗

1.2.1MCT誘導的PAH動物模型的制備 大鼠隨機分為對照組(Control組)、野百合堿3周組(MCT-3W)、野百合堿4周組(MCT-4W)、野百合堿5周組(MCT-5W)，每組10只。分別腹腔注射無菌生理鹽水或MCT 60 mg·kg-1。腹腔注射后，SD大鼠置于恒溫室內飼養(21 ℃，相對濕度50%～70%)，不限食水。本研究相關動物實驗得到北京協和醫學院阜外醫院實驗動物倫理委員會的批準(北京協和醫學院阜外醫院動物委員會，NO. 0000502)。

1.2.2肺血流動力學指標的測量 MCT組注射MCT后3～5周，以及Control組注射生理鹽水后5周，行右心導管測量肺血流動力學指標[10-11]。將13 cm長、尖端彎曲的聚乙烯右心導管(外徑0.9 mm，北京協和醫學院基礎所病理生理學實驗室提供)用肝素生理鹽水預充后，一端連于Powerlab 16/30，一端緩慢送入右側頸外靜脈、右心房、右心室和肺動脈主干，記錄肺循環血流動力學指標(右心室收縮壓、肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓)，右心導管的具體位置以上述部位的典型壓力波形和波幅來確定。

1.2.3大鼠血漿NBL1濃度的測定 右心導管測壓完成后，用采血針經下腔靜脈采血2 mL, EDTA抗凝，4 ℃靜置0.5 h后，3 000 r·min-1離心15 min；吸取上清，分裝保存于-80 ℃冰箱備用。大鼠血漿NBL1濃度的測定分別使用雙抗體夾心法ELISA試劑盒，檢測范圍分別為62.5～4 000 ng·L-1。具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.4心肺組織取材及右室肥厚指數的計算 肺血流動力學測量后，以4 ℃ PBS經下腔靜脈快速沖洗心肺組織，沖洗完畢后，迅速整體剪下心肺組織置于冰塊上；剪下左肺上部，存放于凍存管后，迅速放于-80 ℃液氮中保存，以備后續qPCR和Western blot檢測NBL1表達水平的變化；余肺置于10%中性福爾馬林常溫固定24 h，流水沖洗12 h，制成肺組織蠟塊，用于免疫組織化學檢測NBL1的肺組織定位。

取出心臟，生理鹽水沖凈，去除左右心房及相連大血管, 將右心室(right ventricular, RV)、左心室(left ventricular, LV)及室間隔(interventricular septum，IVS)剪下，濾紙吸干后稱重。按如下公式計算右室肥厚指數(fulton index): Fulton index=RV/(LV+IVS)。

1.3 體外細胞功能學實驗人肺動脈內皮細胞購于ScienCell公司，將液氮中凍存的肺動脈內皮細胞進行復蘇及傳代，置于37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養箱中，以完全內皮細胞培養液培養。將2～3代的肺動脈內皮細胞以2×105個細胞接種于25 cm2塑料細胞培養瓶，培養至融合率達到80%～90%后，進行后續的細胞功能學實驗。分為4組：對照組、BMP-2/4(20 μg·L-1)刺激組、NBL1(100、2 000 μg·L-1)+BMP-2/4(20 μg·L-1)組。

1.4 實時熒光定量PCR檢測TRIzol法提取肺組織總RNA，取純化的RNA 1 μg逆轉錄為cDNA，利用qPCR方法檢測NBL1 mRNA的表達變化[12]。各引物序列如下: NBL1正向引物5′-CCACAGGATGCCTGAAGATGAA-3′, 反向引物5′-AGGTTAGCCTGGGCAGGATTG-3′; GAPDH正向引物5′-GGCACAGTCAAGGCGAGAATG -3′, 反向引物5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

1.5 Western blot實驗提取制備肺組織或肺動脈內皮細胞總蛋白樣品，二辛可酸法測定蛋白樣品濃度后，各肺組織標本取50 μg蛋白，100 ℃加熱5 min蛋白變性，然后4%～12%的Nu-PAGE預制膠上行電泳分離蛋白質; 經半干轉的方式將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂牛奶常溫下封閉1 h，一抗 (抗NBL 1 ∶500，抗GAPDH 1 ∶5 000) 4 ℃搖床孵育過夜; 洗膜緩沖液漂洗后，加入IRDye 680二抗 (1 ∶1 000)，室溫下反應1 h后，TBST再次洗滌，使用奧德賽紅外成像系統進行成像。

1.6 免疫組織化學染色取肺組織蠟塊，切片(2～4 μm)，貼片, 二甲苯透明及無水乙醇梯度脫水，PBS洗滌，5 min×3次，100 ℃沸水中高壓修復抗原; 滴加Triton X-100(體積分數0.3%)破細胞膜，并孵育20 min; 山羊血清封閉非特異性位點20 min后，滴加抗NBL1一抗 (1 ∶400)，4 ℃孵育過夜，37 ℃復溫45 min, PBS洗滌，5 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標記二抗 (1 ∶400)，37 ℃孵育1 h; PBS洗滌，5 min×3次，DAB顯色液顯色5～10 min，顯微鏡下掌握好顯色程度，流水沖洗10 min終止顯色; 蘇木精復染2 min；1%鹽酸乙醇分化20 s；流水沖洗10 min；乙醇梯度脫水；二甲苯透明；封片，鏡檢拍片(顯棕褐色者為陽性)。

2 結果

2.1 實驗動物總體存活情況與PAH模型程度的評估注射操作未引發相關死亡。Control組飼養過程中無死亡；MCT-3W組死亡1只，MCT-4W組死亡3只，MCT-5W組死亡4只，尸檢發現胸腔積液，肝臟淤血硬化，死亡原因考慮為心力衰竭，剩余的實驗動物全部存活至取材時間，右心導管測壓過程無操作相關死亡，相應數據全部包括在最后的數據分析中。

腹腔注射MCT 3周～5周期間，MCT組的肺血流動力學指標(右室收縮壓、肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓)和右心室肥厚程度均較對照組大鼠明顯升高，且這種升高表現為時間依賴的漸進性升高(Tab 1)。提示MCT在SD大鼠上成功誘導出典型的PAH疾病狀態，能很好地模擬PAH的病理生理學狀態。

2.2 NBL1 mRNA在PAH大鼠肺組織中的表達變化如Fig 1所示，與對照組相比，MCT誘導的PAH大鼠肺組織NBL1 mRNA水平呈時間依賴性的降低，MCT注射后3周開始, SD大鼠肺組織NBL1 mRNA水平開始明顯降低，3周、4周、5周時較對照組分別下降70%、81%和89%。

Tab 1 Hemodynamic indices and right ventricular hypertrophy index of rats

RVSP: right ventricular systolic pressure value; PASP: pulmonary artery systolic pressure value; mPAP: mean pulmonary artery pressure value; Fulton index: right ventricular hypertrophy index.**P<0.01vscontrol.

Fig 1 Changes of NBL1 mRNA levels in MCT induced PAH rat lungs

##P<0.01vscontrol group.

2.3 NBL1蛋白在PAH大鼠肺組織中的表達變化如Fig 2所示，與對照組相比，MCT誘導的PAH大鼠肺組織NBL1的蛋白水平呈時間依賴性的降低，MCT注射后3周開始, SD大鼠肺組織NBL1蛋白水平較對照組開始降低，5周時幾乎檢測不到。

Fig 2 Expression trend of protein level of NBL1 in rat lungs with MCT-induced PAH

##P<0.01vscontrol group

2.4 NBL1在MCT誘導的PAH肺組織中的變化趨勢免疫組織化學染色顯示(Fig 3)，NBL1在正常肺組織肺小動脈管壁中強表達，但在MCT誘導的PAH大鼠肺組織中，中膜肥厚的肺小動脈管壁中僅檢測到微弱的NBL1表達。

Fig 3 Localization of NBL1 protein in pulmonary arterioles (×1000)

A: Normal pulmonary artery in lungs from control group; B: Pulmonary artery with mild thickened media in lungs from MCT-5 weeks group; C: Pulmonary artery with severe thickened media in lungs from MCT-5 weeks group.

2.5 NBL1血漿濃度在PAH大鼠中的變化趨勢Fig 4的ELISA結果顯示，MCT誘導的PAH大鼠NBL1血漿濃度較對照組呈現出時間依賴性的明顯降低。Fig 5的相關性分析顯示，大鼠血漿NBL1濃度與右心導管測定的右心室收縮壓(r=-0.762 2，P<0.01)、肺動脈收縮壓(r=-0.767 1，P<0.01)、平均肺動脈壓(r=-0.789 6，P<0.01)及右室肥厚指數(r=-0.812 9，P<0.01)均呈明顯負相關。

Fig 4 Change trend of plasma concentration of NBL1 in rats

##P<0.01vscontrol group

2.6 NBL1抑制BMP2/4誘導的肺動脈內皮細胞Smad 1/5/8信號通路的激活為了明確NBL1在PAH發生、發展中的作用機制，我們進行了細胞水平的研究。與預期一致，BMP2/4能誘導肺動脈內皮細胞Smad 1/5/8的磷酸化，提示肺動脈內皮細胞BMP信號通路的激活；而NBL1則濃度依賴性地抑制BMP2/4引起的肺動脈內皮細胞內Smad 1/5/8的磷酸化，提示NBL1能抑制BMP信號通路的激活。見Fig 6。

Fig 5 NBL1 plasma concentration presented a negative correlation with extent of PAH in rats with MCT-induced PAH

3 討論

PAH是炎癥、低氧、體-肺分流、基因突變等原因引起的，以肺血管嚴重重構導致肺血管阻力增高為特征的慢性致死性疾病[1]。研究已發現眾多導致PAH的分子機制，信號通路靶向藥物也已用于臨床治療，PAH患者的癥狀雖有改善，但患者的病死率并未明顯改善[2]，說明PAH研究領域中尚有未被闡明的發病機制。

NBL1是一種普遍存在于哺乳動物組織和體液中的分泌型蛋白質，起初在大鼠成纖維細胞轉化模型中發現其具有抑制腫瘤作用[3]。后續研究發現，NBL1的表達水平在一些表型轉換的細胞中明顯下調，而NBL1的過表達則抑制靜止細胞進入細胞周期的S期[4,9]。因此，NBL1或是細胞增殖的負調節因子，其下調或缺失或可導致細胞表型的轉換。而肺動脈細胞組份表型的轉換，即從靜止的、非可遷移的分化表型轉化為增殖、可遷移的合成或分泌表型，是PAH進展的主要特點[13]。因此，我們推測NBL1在PAH肺組織和血漿中的變化，可能參與了PAH的發生和發展。

目前，PAH研究中多采用MCT誘導的大鼠PAH模型，此模型制備簡單，進展迅速，且個體間PAH程度較均一。另外，在此模型上，先前的研究發現了PAH的諸多發病機制，因此，MCT誘導的PAH大鼠模型是可靠的PAH動物模型[11, 14]。本研究發現，腹腔注射MCT 3周后，SD大鼠肺血流動力學指標(右室收縮壓、肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓)及右室肥厚指數均呈現時間依賴性的明顯升高，證明MCT誘導的PAH模型制備成功。在此基礎上，我們研究了NBL1水平在MCT誘導的PAH肺組織和血漿中的變化趨勢及其臨床意義。

Fig 6 NBL1 inhibited activation of BMP signal of pulmonary artery endothelial cells induced by BMP2/4 n=3)

A: NBL1 dose-dependently inhibited BMP-2 induced Smad 1/5/8 phosphoralation; B: NBL1 dose-dependently inhibited BMP-4 induced Smad 1/5/8 phosphoralation.##P<0.01vscontrol group；**P<0.01vsBMP4 group.

先前的研究發現，除肝臟外，NBL1在多種組織器官中均有表達，當然表達的水平不盡相同，其中肺組織的表達最高[3-5]，提示其在肺組織中存在特異性表達的可能，但NBL1在肺組織發育及病理狀態下的作用至今沒有研究。本研究發現，MCT誘導PAH大鼠肺組織NBL1的mRNA水平和蛋白水平呈現時間依賴性的逐步降低，且在正常肺組織中，NBL1在肺小動脈管壁中高表達，而在重構的肺小動脈中幾乎檢測不到NBL1的表達。BMP受體Ⅱ的致病性突變及BMP信號通路活性的下降，在PAH的進程中發揮重要作用[15-16]。我們的結果表明，在肺動脈內皮細胞中，NBL1可以拮抗BMP-2和BMP-4刺激Smad 1/5/8磷酸化的作用，提示NBL1可拮抗肺動脈內皮細胞中BMP信號通路的激活。本研究發現，MCT注射后，肺組織NBL1表達水平逐步降低，理論上講，會減弱其對BMP信號通路的抑制作用，有拮抗炎癥性PAH進展的潛在作用。目前，臨床工作中常用心臟超聲、右心導管及肺活檢來評價PAH程度，近來生物標志物在PAH領域的研究結果令人鼓舞，有望在PAH的臨床篩選、診斷、預后評估及隨訪等方面發揮重要作用[15]。因此，尋找PAH的生物標志物，協助準確界定PAH程度，可為PAH的臨床干預提供可靠的理論依據。本研究的ELISA結果表明，MCT誘導的PAH大鼠模型中，NBL1的血漿濃度亦隨MCT注射后時間的延長而逐漸降低，且與肺血流動力學指標和右室肥厚指數均呈明顯負相關，提示NBL1血漿濃度可反映PAH嚴重程度，但PAH病人NBL1血漿濃度的變化尚無研究報道。因此，NBL1作為PAH臨床生物標記物的可行性尚需進一步的臨床驗證。

總之，本實驗證實在MCT誘導的PAH大鼠的肺組織及血漿中，NBL1的水平隨著PAH的發生、發展而逐漸降低, 與PAH嚴重程度呈明顯的相關性, 說明NBL1血漿水平或是PAH潛在的生物標志物。