復方蜚蠊提取物PB對異體抗原聯合醋酸誘導大鼠慢性潰瘍性結腸炎的作用機制

盧 倩，孫敏哲，杜雯雯，劉 衡， 沈詠梅，吳桃清，趙 昱,，巫秀美

(1. 大理大學云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心，中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發利用協同創新中心，云南 大理 671000；2. 藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，四川 成都 610000)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因和發病機制尚不明確的炎癥性腸病。該病通常反復發作，發病時主要臨床表現為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、體質量減輕等[1]。臨床以發作、緩解及復發交替為特點，是常見的消化系統疾病[2]。研究表明[3]，UC的主要病理機制可能與免疫功能、細胞炎癥因子調控網絡失衡、腸道菌群失調等有關。目前，UC的治療主要以5-氨基水楊酸類、糖皮質激素類或免疫抑制劑類藥物為主[4]，長期用藥有一定的副作用，療效降低。研究發現，中藥復方保留灌腸治療輕、中度UC具有明顯的療效[5]。

美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)是蜚蠊科中體積最大的昆蟲，最早作為中藥記錄于神農本草經中，謂“性咸”、“味平”，歸肝腎脾經，主血瘀，癥堅，具有消積生肌，清熱解毒等功效。臨床常用于小兒疳積、咽喉腫痛、蟲蛇咬傷、瘡癰腫毒、消化道潰瘍等[6]。美洲大蠊具有抗腫瘤、抗感染、提高機體免疫力、促進組織修復、抗炎鎮痛等多方面藥理作用[7]。研究發現，以美洲大蠊干燥蟲體的提取物為有效成分的中成藥康復新液，在臨床上保留灌腸治療UC具有明顯的療效[8]。因此，本實驗在此研究基礎上，將蜚蠊、蒲公英、薏苡仁、烏梅、陳皮按5 ∶2 ∶1 ∶1 ∶1組方配比，通過水提醇沉的方式獲得復方蜚蠊提取物PB，采用灌腸給藥的方法治療異體抗原聯合醋酸誘導的慢性UC大鼠，考察復方蜚蠊提取物PB對慢性UC的療效及作用機制，為其用于慢性UC的治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物健康SPF級2月齡SD大鼠86只，♀♂各半，體質量(200±10)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2016-0004，飼養于大理大學IVC動物中心。適應性飼養健康家兔50只，♀♂不拘，體質量(3.0～3.5) kg，大理大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(滇)2008-0003。

1.2 藥物與試劑復方蜚蠊提取物PB(包括蜚蠊、蒲公英、薏苡仁、烏梅、陳皮等混合提取物)(批號：20150724)，由大理大學昆蟲生物醫藥研究院張成桂副教授提供；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine，SASP)(批號：09160503)，上海信宜天平藥業有限公司；腸炎寧(批號：160303)，江西天施康弋陽制藥有限公司；冰醋酸(批號：20130114)，天津市瑞金特化學品有限公司；完全弗氏佐劑(批號：SLBK1733)，Sigma公司；大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒(批號：R160927-102a)、白細胞介素4(interleukin 4，IL-4)ELISA試劑盒(批號：R160927-002b)、IL-8 ELISA試劑盒(批號：R161025-008b)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)試劑盒(批號 R161025-101b)，均購自于欣博盛QuantiCyto?生物科技有限公司；大鼠C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)試劑盒(批號：20151215)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)試劑盒(批號：20161101)、IL-17試劑盒(批號：20161228)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒(批號：20161022)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)試劑盒(批號：20161228)、隱血試劑盒(批號：20160823)，均購于南京建成生物科技有限公司。

1.3 儀器TL-16R臺式高速冷凍離心機(上海離心機機械研究所)；T6新世紀紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；2010酶標儀(奧地利安圖斯公司)。

2 方法

2.1 異體抗原乳化劑的制備[9]取家兔新鮮結腸50根，刮取兔結腸黏膜，加入適量氯化鈉溶液制成勻漿液，-20 ℃過夜，解凍后，4 000 r·min-1、4 ℃冷凍離心30 min，取上清液于-20 ℃過夜，解凍后，4 000 r·min-1、4 ℃離心30 min，再轉移至-80 ℃過夜后凍干，制備成家兔結腸抗原凍干粉，-20 ℃放置備用。異體抗原乳化劑每次臨用前配制，精密稱取家兔結腸抗原凍干粉600 mg(每只8 mg)，加入3.75 mL氯化鈉溶液溶解，待完全溶解后，取3.75 mL完全弗氏佐劑，渦旋混勻制備成異體抗原乳化劑。

2.2 動物模型建立[9]于d 1、8、15、22、29，取異體抗原乳化劑(現配現用)，分別在大鼠左側足跖、右側足趾、腹股溝、背部皮下、腹腔注射異體抗原乳化劑0.1 mL(每只含抗原8 mg，完全弗氏佐劑0.05 mL，末次注射不加佐劑)，末次注射禁食不禁水24 h后，對大鼠用5%醋酸1 mL灌腸，留置15 s，用氯化鈉溶液4 mL沖洗后，再用異體抗原乳化劑1 mL灌腸，留置30 min后，用4 mL氯化鈉溶液洗凈排出，造模完成。

2.3 分組及給藥正常組大鼠不造模(10只)，其余76只大鼠造模后，參考Hamamoto等[10]標準進行疾病活動指數(disease activity index，DAI)評分，按照大鼠DAI評分(0～3分為極輕度炎癥，4～6分為輕度炎癥，7～9分為中度炎癥，10～12分為重度炎癥)，剔除極輕度炎癥和重度炎癥大鼠，剩余60只大鼠按炎癥嚴重程度分層隨機分組：模型組(Model)、柳氮磺胺吡啶組(SASP 300 mg·kg-1)、腸炎寧組(Changyanning 300 mg·kg-1)、復方蜚蠊提取物PB低、中、高劑量組(PB 50、100、200 mg·kg-1)，每組10只，♀♂各半。除正常組、模型組灌腸0.9%氯化鈉溶液外，其余各組灌腸給予相應的藥物，每天1次，連續14 d。

2.4 觀察指標及方法記錄各組大鼠給藥d 1、4、7、10、14的DAI評分。末次給藥24 h后，用質量分數為10 g·L-1的水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，4 ℃靜置4 h，3 500 r·min-1離心10 min，取上層血清，按試劑盒說明檢測IL-4、IL-8、IL-17、IFN-γ、CRP、IgG含量。解剖取出結腸，沿腸系膜緣剪開腸腔，氯化鈉溶液沖洗糞便，觀察腸壁，稱量濕質量，采集結腸照片，參照標準[11]并進行結腸黏膜損傷指數(colonic mucosal damage index, CMDI)評分；切取病變嚴重區域結腸0.15 g，按1 ∶9(W/V)氯化鈉溶液勻漿，3 500 r·min-1離心10 min，取上清液，按試劑盒說明檢測上清液中TNF-α、MPO、EGF含量。剩余結腸用40 g·L-1甲醛固定，制作病理切片，并參照Ekstr?m[12]標準進行病理組織學評分(histopathological score，HS)。解剖取出肝臟、脾臟、胸腺等臟器，稱量質量，計算臟器指數：臟器指數/%=各臟器質量/體質量×100%。

3 結果

3.1 復方蜚蠊提取物PB對慢性UC大鼠DAI評分的影響異體抗原聯合醋酸造模期間，除正常組以外，各組大鼠均出現不同程度的厭食、懶動、體質量下降、腹瀉、血便等情況。Tab 1結果顯示，實驗期間，正常組大鼠DAI評分較小且基本不變；根據給藥d 1的DAI評分，模型組DAI評分與正常組DAI評分差異有顯著性(P<0.01)，提示模型建立成功；復方蜚蠊提取物PB灌腸給藥d 14，PB各劑量組DAI評分均較低，提示經復方蜚蠊提取物PB灌腸給藥治療后，大鼠的慢性UC癥狀在一定程度上得到緩解。與模型組比較，PB中劑量組DAI評分最低(P<0.01)，接近正常組。

Tab 1 Effect of Blattidae compound PB on DAI score of UC rats n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal；##P<0.01vsmodel

Tab 2 Effect of Blattidae compound PB on colon-related index in UC rats n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel;△△P<0.01vsSASP

3.2 復方蜚蠊提取物PB對慢性UC大鼠結腸長度、寬度、CMDI評分和結腸指數的影響正常組大鼠腸壁肉眼觀察結腸黏膜無明顯水腫、糜爛和潰瘍形成；模型組大鼠腸壁可見明顯的充血與水腫。與正常組相比，模型組大鼠結腸長度變短，寬度變寬，CMDI評分最高(P<0.01)。與模型組比較，SASP組和腸炎寧組大鼠結腸長度變長，寬度變窄，CMDI評分降低，差異均具有統計學意義(P<0.01)；復方蜚蠊提取物PB各劑量組大鼠結腸長度無顯著性差異，結腸寬度明顯變窄(P<0.01)，CMDI明顯降低(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，SASP組、腸炎寧組和PB中、高劑量組結腸指數明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見Tab 2。

3.3 復方蜚蠊提取物PB對慢性UC大鼠臟器指數的影響Tab 3結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝臟、胸腺及脾臟指數均升高，但差異無顯著性。復方蜚蠊提取物PB低劑量組的肝臟指數，以及PB中劑量組的胸腺指數均升高(P<0.05)。與模型組比較，PB低劑量組肝臟、脾臟指數以及PB中、高劑量組胸腺指數均升高，但差異無顯著性。

3.4 復方蜚蠊提取物PB對慢性UC大鼠血清生化指標的影響如Tab 4所示，與正常組比較，模型組大鼠IL-8、IL-17、CRP、IFN-γ、IgG含量均明顯升高(P<0.01)，而IL-4含量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，SASP組、腸炎寧組、復方蜚蠊提取物PB各劑量組大鼠IL-8、IL-17、CRP、IFN-γ、IgG含量均明顯降低(P<0.01)；SASP組、腸炎寧組、PB高劑量組IL-4含量明顯升高(P<0.01)。與SASP組比較，PB低劑量組大鼠IL-4、IL-8含量明顯降低(P<0.01)，IL-17、IFN-γ含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

Tab 3 Effect of Blattidae compound PB on organ index in UC rats n=10)

*P<0.05vsnormal

3.5 復方蜚蠊提取物PB對慢性UC大鼠結腸組織生化指標的影響如Tab 5所示，與正常組比較，模型組大鼠EGF含量明顯降低，MPO、TNF-α含量均明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，SASP組、腸炎寧組、復方蜚蠊提取物PB中劑量組大鼠結腸組織中TNF-α、MPO含量明顯降低(P<0.01)，SASP組、腸炎寧組大鼠結腸組織中EGF含量明顯升高(P<0.01)。

Tab 4 Effect of Blattidae compound PB on serum IL-4, IFN-γ, IL-8, IL-17,CRP and IgG contents in UC rats n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel;△P<0.05,△△P<0.01vsSASP;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsChangyanning

Tab 5 Effect of Blattidae compound PB on TNF-α, MPO and MPO in colonic tissues of UC rats

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel;△△P<0.01vsSASP;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsChangyanning

3.6 復方蜚蠊提取物PB對慢性UC大鼠結腸組織HS的影響Tab 6、Fig 1結果顯示，正常組大鼠結腸黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層結構完整清晰，腸黏膜上皮細胞形態正常，腺體排列整齊，隱窩正常，無充血水腫、炎性細胞浸潤現象；模型組大鼠結腸黏膜不同程度的破損，杯狀細胞和隱窩大量丟失，黏膜層和黏膜基層炎性細胞浸潤，并伴有水腫。與正常組相比，模型組大鼠上皮細胞、炎性細胞及HS評分均明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，SASP組、腸炎寧組及復方蜚蠊提取物PB低、中、高劑量組大鼠上皮細胞、炎性細胞及HS評分均明顯降低(P<0.01)；PB高劑量組與陽性藥SASP組數值相當，PB低、中劑量組數值與陽性藥腸炎寧組相當。

Tab 6 Effect of Blattidae compound PB on HS score of UC rats n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel;△P<0.05,△△P<0.01vsSASP

Fig 1 The pathological sectionof rat UC organization by
clysis way(HE, ×200)

A：Normal; B：Model; C：SASP; D：Changyanning; E：PB high dose; F：PB medium dose; G：PB low dose

4 討論

本研究采用異體抗原聯合醋酸誘導大鼠慢性UC，大鼠在造模后出現腹瀉、血便、體質量下降等癥狀，肉眼可見結腸黏膜糜爛和潰瘍形成，鏡下可見模型組大鼠結腸有大量炎性細胞浸潤，血清中CRP含量明顯升高。MPO是中性粒細胞產生的一種重要的過氧化物酶，其活性高低是判斷中性粒細胞浸潤程度的重要指標，也是結腸炎癥嚴重程度的重要指標[13]。模型組HS評分、結腸黏膜MPO、TNF-α含量明顯高于正常組；與模型組比較，陽性藥SASP組、腸炎寧組和復方蜚蠊提取物PB各劑量組HS評分、結腸黏膜MPO、TNF-α表達量均不同程度降低。結果提示，復方蜚蠊提取物PB可以降低中性粒細胞表達，促進黏膜修復，改善結腸病理組織變化。

目前研究認為，效應CD4+T細胞的異常活化可能是導致潰瘍性結腸炎腸黏膜免疫和后續炎癥反應的重要機制之一[14]。CD4+T細胞主要包括Th1、Th2、Th17和調節性T細胞，參與體內多種免疫應答和炎癥反應。INF-γ、IL-8、TNF-α主要是Th1細胞分泌的促炎因子，在清除細胞內病原體中發揮重要作用；Th2細胞能分泌IL-4、TGF-β1等細胞因子，協助激活B細胞產生特異性抗體IgG，以清除細胞外病原體；Th17細胞是一類與Th1細胞和Th2細胞亞群不同分化機制和功能特性的新型CD4+T細胞亞群，主要分泌IL-17、IL-23等細胞因子。IL-17具有較強激活中性粒細胞的能力，可誘導炎癥的發生和導致組織損傷。本實驗中，模型組大鼠血清中IL-17、INF-γ、IL-8、IgG含量均明顯升高，而IL-4含量明顯降低，提示模型組大鼠結腸黏膜損傷，上皮細胞新陳代謝功能障礙，有大量炎癥細胞浸潤，Th1/Th2平衡失調且傾向于Th1。而慢性UC大鼠經過復方蜚蠊提取物灌腸治療后，UC癥狀明顯改善，大鼠體質量增加，精神逐漸恢復，血便、稀便等癥狀減輕，排便頻數下降；血清中IL-17、IL-8、IFN-γ、IgG含量明顯降低，血清中IL-4的含量明顯升高。提示復方蜚蠊提取物PB可以調節炎癥因子的表達，減少炎癥細胞浸潤，減輕炎癥反應，調節機體細胞免疫和體液免疫，使機體細胞免疫功能恢復平衡。

綜上所述，復方蜚蠊提取物可以通過調節細胞免疫和體液免疫治療UC，但是復方蜚蠊提取物PB治療慢性UC并未出現明顯的劑量依賴性，可能與中藥復方制劑量效關系異常復雜有關。中藥復方的量效關系不僅有化學藥物的共同屬性，同時又具有鮮明的中醫藥特色，中藥復方在一系列復雜的化學反應后，每個單位被重新拆分和組合，形成了新的療效物質成分[15]。由此可見，中藥復方的量效關系復雜，如何確定中藥復方劑量在臨床上的療效，仍然是中藥科研者需要面臨的問題之一。

(致謝：感謝大理大學昆蟲生物醫藥研究院張俊、唐苗、余萬鑫及大理大學動物實驗中心吳定宇老師對本課題的支持！)