雌二醇調(diào)控VEGFα表達(dá)誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞血管形成

任祥春，季 爽，張文英，費廣鶴

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，安徽 合肥 230022)

肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，中國女性的肺癌發(fā)病率僅次于乳腺癌，位于第2位，但死亡率遠(yuǎn)高于乳腺癌，位于第1位[1]。男性和女性肺癌患者的發(fā)病特點不同，女性以非吸煙者居多，腺癌居多[2-3]。這種由性別差異造成的肺癌發(fā)病率不同，歸因于內(nèi)源性激素的差異[2]。雌激素是一種類固醇性激素，通過和受體結(jié)合發(fā)揮作用。雌激素受體主要包括雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)和雌激素受體β(estrogen receptor β，ERβ)，其中ERβ是雌激素在肺部發(fā)揮生理效應(yīng)的主要介導(dǎo)受體[4]。本課題組前期研究結(jié)果也表明，ERβ在絕經(jīng)前女性肺腺癌患者癌組織中高表達(dá)[5]，但具體的發(fā)病機制仍不清楚。血管內(nèi)皮生長因子α(vascular endothelial growth factor α，VEGFα)是一種特異性較高，誘導(dǎo)腫瘤血管生成較強的調(diào)節(jié)因子，通過增加血管內(nèi)皮的有絲分裂，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，重塑細(xì)胞外基質(zhì)，增加血管通透性，與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-7]。本文旨在探討雌激素調(diào)控肺腺癌A549細(xì)胞中VEGFα，誘導(dǎo)肺血管生成的發(fā)病機制，為深入研究靶向抑制藥物和肺腺癌的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人肺腺癌A549細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，購自上海復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞庫。

1.2 試劑與儀器RPMI 1640、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)，購自Gibco公司；基質(zhì)膠，購自Corning公司;兔源性VEGFα和β-actin抗體，購自CST公司；MTT、胰酶消化液，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ELISA試劑盒，購自北京博凌科為生物科技有限公司；雌二醇(17β-estradiol,E2)，購自Sigma公司；雌激素受體拮抗劑ICI)，購自MCE公司。酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國賽默飛公司)；超凈工作臺(蘇州金燕凈化設(shè)備有限公司)；低速離心機(德國Eppendorf公司)；倒置顯微鏡與照像系統(tǒng)(日本Nikon公司)；電泳儀、轉(zhuǎn)印儀(美國伯樂公司)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 將凍存的A549細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞立即放入37 ℃溫水中快速搖晃，直至融化，分別接種于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液和含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日觀察，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，換取新的培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁生長至培養(yǎng)皿的85%～90%時，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗后，取1 mL的胰蛋白酶放入培養(yǎng)皿中，置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化2～3 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞回縮變圓時，再分別用含10% FBS的RPMI 1640和含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液輕輕吹打后重懸、離心，棄去上層液，用含10% FBS的培養(yǎng)液重懸，按1 ∶3比例傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.2Western blot 收集PBS組、10 nmol·L-1E2組、10 nmol·L-1E2+5 μmol·L-1雌激素受體抑制劑ICI組的A549細(xì)胞，提取蛋白，定量后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳；然后將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜；用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別加VEGFα和β-actin的一抗 (1 ∶1 000稀釋) 4 ℃過夜；次日，PBST洗膜，添加對應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯影，記錄分析實驗結(jié)果。

1.3.3酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) ELISA法檢測A549細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGFα水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3.4MTT實驗 本實驗分為PBS組、10 nmol·L-1E2組、10 nmol·L-1E2+5 μmol·L-1ICI三組，分別評估HUVEC細(xì)胞增殖活力。收集HUVEC對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個每孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。5% CO2、37 ℃孵育至細(xì)胞貼壁，次日分別加入PBS、E2、E2+ICI預(yù)處理后的A549細(xì)胞培養(yǎng)基，設(shè)4個復(fù)孔，5% CO2、37 ℃孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔中的MTT溶液，然后加入150 μL DMSO，置搖床上低速搖晃10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度OD值，計算樣品濃度。

1.3.5劃痕實驗 將A549細(xì)胞分為3組，分別給予PBS、10 nmol·L-1E2、10 nmol·L-1E2+5 μmol·L-1ICI預(yù)處理，取5×105的HUVEC細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，待其處于對數(shù)生長期時，使用20 μL的槍頭在單層細(xì)胞表面劃痕，PBS漂洗2次，再加入3組培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別在劃痕后0、24 h拍照，觀察細(xì)胞的相對遷移距離。使用ImageJ軟件計算細(xì)胞遷移距離，遷移距離=(遷移前兩側(cè)細(xì)胞間距-遷移后兩側(cè)細(xì)胞間距)。

1.3.6小管生成實驗 A549細(xì)胞分組同“1.3.5”。在96孔板上預(yù)先鋪基質(zhì)膠每孔50 μL，置于37 ℃孵箱中放置1 h凝固后，按50 000個/孔接種HUVEC細(xì)胞，分別加入3組A549細(xì)胞培養(yǎng)上清，37 ℃培養(yǎng)24 h后拍照記錄，使用ImageJ軟件計算小管形成長度。

2 結(jié)果

2.1 E2和雌激素受體拮抗劑ICI影響A549細(xì)胞中VEGFα的表達(dá)如Fig 1A所示，與PBS組相比，E2組A549細(xì)胞中VEGFα蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)；與E2組相比，E2+ICI組細(xì)胞中VEGFα蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。采用ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGFα的表達(dá)，趨勢和Western blot檢測VEGFα的蛋白表達(dá)一致(Fig 1B)。

Fig 1 Expression of VEGFα in A549 cells affected by E2 and ICI n=3)

A: Western blot analysis for VEGFα in A549 cells; B: ELISA analysis for VEGFα in A549 culture media.**P<0.01vsPBS group;##P<0.01vsE2 group.

2.2 E2和ICI作用的A549細(xì)胞上清對HUVEC細(xì)胞增殖能力的影響如Fig 2所示，與PBS組相比，E2組中HUVEC細(xì)胞的增殖能力明顯升高(P<0.01)；與E2組相比，E2+ICI組HUVEC細(xì)胞的增殖能力明顯降低(P<0.05)。

Fig 2 Cell proliferation of HUVECs cultured with A549 conditioned media by MTT n=3)

**P<0.01vsPBS group;#P<0.05vsE2 group

2.3 E2和ICI作用的A549細(xì)胞上清對HUVEC細(xì)胞遷移能力的影響Fig 3結(jié)果顯示，是否添加VEGFα抗體，對HUVEC細(xì)胞的遷移距離有影響。未添加VEGFα抗體組中，與PBS組相比，E2組的細(xì)胞遷移距離明顯增加(P<0.01)；與E2組比較，E2+ICI組的細(xì)胞遷移距離明顯減小(P<0.01)。加入VEGFα抗體組中，PBS組、E2組、E2+ICI組的3組間遷移距離差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

A: HUVEC was cultured with A549 conditioned media without VEGFα antibody; B: HUVEC was cultured with A549 conditioned media with VEGFα antibody; C: The migration distance was analyzed.**P<0.01vsPBS group;##P<0.01vsE2 group.

2.4 E2和ICI作用的A549細(xì)胞上清對HUVEC細(xì)胞小管形成能力的影響Fig 4結(jié)果顯示，是否加入VEGFα抗體，對HUVEC細(xì)胞的小管形成長度有影響。在未添加VEGFα抗體的組中，與PBS組比較，E2組的小管生成長度增加(P<0.01)；與E2組相比，E2+ICI組的小管生成長度減小(P<0.01)。在添加VEGF抗體的組中，PBS組、E2組和E2+ICI組，3組間的小管生成長度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

A: HUVEC was cultured with A549 conditioned media without VEGFα antibody. The tube formation length was calculated 24 h later. B: HUVEC was cultured with A549 conditioned media with VEGFα antibody.The tube formation length was calculated 24 h later.C: The tube formation length was analyzed by ImageJ.**P<0.01vsPBS group;##P<0.01vsE2 group.

3 討論

近年來，肺腺癌在無吸煙史的女性患者中發(fā)病率不斷升高，但具體的發(fā)病機制仍不清楚，可能與女性內(nèi)源性的性激素有關(guān)。本課題組的前期研究表明，與絕經(jīng)后女性相比，絕經(jīng)前女性肺腺癌患者癌組織中ERβ表達(dá)水平明顯升高[5]。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入探討雌激素和肺腺癌的關(guān)系。結(jié)果表明，E2和肺腺癌A549細(xì)胞中雌激素受體ERβ結(jié)合后，VEGFα的表達(dá)增加，促進(jìn)了HUVEC細(xì)胞的增殖、遷移和小管形成；加入VEGFα抗體后，明顯抑制了HUVEC細(xì)胞的遷移和小管形成。既往研究指出，在直徑超過2 mm的實體腫瘤中，肺部腫瘤微環(huán)境中的血管形成，在肺癌細(xì)胞的生長、黏附、轉(zhuǎn)移和侵襲中起主導(dǎo)作用[7-8]。由此可見，VEGFα在肺腺癌A549細(xì)胞的血管微環(huán)境形成中發(fā)揮重要作用。國內(nèi)文獻(xiàn)指出，乳腺癌中有70%～80%為雌激素受體陽性乳腺癌[9]，所以在乳腺癌中關(guān)于此方面的研究較多，大量研究也支持我們的實驗結(jié)果：E2通過和G蛋白偶聯(lián)受體GPR30(GPER)結(jié)合，激活HIF-1α/VEGF信號通路，促進(jìn)了乳腺癌腫瘤血管的形成[10-12]。在甲狀腺癌中，E2通過激活PI3K/Akt信號通路，使VEGFα的表達(dá)量增加[13]。同時本實驗結(jié)果還表明，雌激素受體拮抗劑ICI發(fā)揮抑制E2的促腫瘤微血管形成的作用。在肺癌的靶向治療中，既往對經(jīng)典的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)靶點研究較多，但其突變率較低，服藥后期的耐藥率較高。因而，近年來在非小細(xì)胞肺癌靶向治療中，采用酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合雌激素受體抑制劑ICI，可有效增強抗腫瘤作用[14]，但是在女性肺腺癌中缺少此方面的深入研究。本研究結(jié)果為女性肺腺癌的靶向精準(zhǔn)治療提供了理論依據(jù)。

綜上所述，在肺腺癌A549細(xì)胞中，雌激素可能是通過和高親和性的雌激素受體ERβ結(jié)合，增加了VEGFα的表達(dá)，促進(jìn)肺腺癌血管內(nèi)皮的增殖、遷移和小管形成能力；雌激素受體拮抗劑ICI和VEGFα抗體的作用相反。本實驗的研究結(jié)果進(jìn)一步證實了雌激素通過調(diào)控VEGFα的表達(dá)，在肺腺癌微血管形成中的重要作用，為臨床治療提供新思路。

(本實驗是在安徽醫(yī)科大學(xué)安徽省人獸共患病重點實驗室完成，感謝沈繼龍老師及其團(tuán)隊所給予的支持和幫助)