環氧澤瀉烯對2型糖尿病小鼠的降糖作用

張偉云，王明軍，劉華欣，王 青，陳全成

(1.廈門醫學院藥學系，福建 廈門 361023；2.廈門大學藥學院，福建 廈門 361102)

糖尿病是一種嚴重危害健康的代謝性疾病[1]。糖尿病患者中90%以上屬于2型糖尿病，2型糖尿病主要特征是胰島素抵抗和高血糖[2]。糖尿病治療的重點是降低血糖水平，因為高血糖是糖尿病并發癥的主要原因[2-3]。中藥澤瀉[Alismaorientalis(Samuel.) Juzep.]提取物具有較好的降糖活性[4]，但具體的降糖有效成分及其作用機制尚不十分明確。倍半萜類化合物是澤瀉的重要藥效物質基礎之一，其主要代表性成分環氧澤瀉烯(結構式見Fig 1)具有抗炎作用[5]。本實驗為探討環氧澤瀉烯是否具有降血糖活性，應用鏈脲佐菌素和煙酰胺建立了2型糖尿病小鼠模型[6]。羅格列酮通過增強胰島素敏感性，有效控制2型糖尿病患者的血糖[7]，因此，本實驗選用羅格列酮作為陽性對照藥。在誘導3T3-L1前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞后，對胰島素的敏感性增強，新的成熟脂肪細胞加快消耗外部環境中葡萄糖。因此，前脂肪細胞被廣泛應用于降血糖藥物的篩選[8]。本實驗采用3T3-L1前脂肪細胞分化模型，探索了環氧澤瀉烯對前脂肪細胞脂分化過程的影響。

Fig 1 Chemical structure of alismoxide

1 材料

1.1 實驗動物C57BL/6 ♂小鼠，5～6周齡，體質量(21～23) g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物合格證號為2015000501745，適應2周后進行實驗。

1.2 細胞小鼠3T3-L1前脂肪細胞，購自美國菌種保藏中心。

1.3 藥物與試劑鏈脲佐菌素、煙酰胺、葡萄糖、胰島素、羅格列酮、油紅O和哈里斯氏蘇木精染劑，購自美國Sigma-Aldrich公司；葡萄糖熒光示蹤劑2-[N-(7-硝基苯-2-氧代-1，3-重氮基-4-基)氨基]-2-脫氧-D-葡萄糖(2-NBDG)，購自美國Molecular Probes公司；環氧澤瀉烯(純度>98%)，購自成都瑞芬思有限公司；胎牛血清、胰酶、低糖DMEM培養基，購自美國HyClone公司；其他試劑均為分析級。

1.4 儀器羅氏血糖儀(羅氏診斷產品上海有限公司); IFS-110-8型CO2恒溫培養箱(新加坡ESCO公司)；熒光顯微鏡XTZ-Y3(上海天珠光學儀器廠)。

2 方法

2.1 2型糖尿病模型的誘導參照文獻方法[4]，將C57BL/6 ♂小鼠禁食過夜后，腹腔注射240 mg·kg-1煙酰胺，15 min后，腹腔注射100 mg·kg-1鏈脲佐菌素誘導2型糖尿病模型。2 d后再次腹腔注射相同劑量的煙酰胺和鏈脲佐菌素。通過測試3周后小鼠空腹血糖值和d 22口服葡萄糖耐受試驗期間空腹血糖值，來判斷2型糖尿病模型是否誘導成功。與空白對照組相比，腹腔注射煙酰胺和鏈脲佐菌素的小鼠空腹血糖值均高于11.1 mmol·L-1，則提示2型糖尿病小鼠建模成功，并將成模后的小鼠隨機分為糖尿病模型組、10 mg·kg-1羅格列酮組、環氧澤瀉烯組(5、10、20 mg·kg-1)，每組8只小鼠，用于灌胃給藥和測定相應組小鼠血糖濃度、體重。每組分別按照下列方式灌胃3周。空白對照組正常小鼠和2型糖尿病模型組每日灌胃生理鹽水，羅格列酮組每日灌胃羅格列酮10 mg·kg-1，環氧澤瀉烯組按小鼠體重灌胃相應劑量的環氧澤瀉烯。

2.2 造模期間血糖濃度測定第1次注射煙酰胺和鏈脲佐菌素前，采集小鼠血液20 μL，注射后的每7 d采集1次血液，即在d 0、7、14、21，分別使用血糖測試儀測量血糖濃度。d 22進行口服葡萄糖耐量試驗，小鼠禁食過夜后，各組分別灌胃2.0 g·kg-1的葡萄糖溶液，然后，在灌胃葡萄糖溶液前(0 min)，以及灌胃葡萄糖溶液后的第30、60、120 min，分別采集各組小鼠血液標本，測定血糖濃度。d 21空腹血糖值和d 22口服葡萄糖耐量試驗中，血糖值均高于11.1 mmol·L-1的小鼠作為模型組小鼠。

2.3 口服葡萄糖耐量試驗各組灌胃給藥后的d 22進行口服葡萄糖耐量試驗。小鼠禁食過夜后，空白對照組、糖尿病模型組均灌胃生理鹽水，陽性對照組灌胃10 mg·kg-1羅格列酮，測試組分別灌胃5、10、20 mg·kg-1環氧澤瀉烯，2 h后，各組分別灌胃2.0 g·kg-1的葡萄糖溶液，然后，在灌胃葡萄糖溶液前(0 min)，以及灌胃葡萄糖溶液后的第30、60、120 min，分別采集各組小鼠血液標本，測定血糖濃度。

2.4 環氧澤瀉烯對2型糖尿病小鼠降糖活性的測定通過測定灌胃給藥前(d 0)和灌胃給藥后d 7、14、21的空腹血糖水平，比較陽性對照藥羅格列酮及環氧澤瀉烯不同劑量對2型糖尿病小鼠血糖濃度的影響。

2.5 體重測定2型糖尿病模型建立過程中和模型建立之后灌胃給藥期間，測定和記錄各組動物體重。

2.6 細胞培養小鼠3T3-L1前脂肪細胞用添加10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。

2.7 油紅O染色參照文獻方法[9]，3T3-L1前脂肪細胞誘導分化為脂肪細胞。首先，將3T3-L1前脂肪細胞按照4×103個細胞/孔的標準接種到96孔板，用無血清的DMEM培養24 h后，再換成含10%胎牛血清和1 μmol·L-1胰島素的DMEM，并分別用含有環氧澤瀉烯(0.5、1 μmol·L-1)、羅格列酮(0.5、1 μmol·L-1)的DMEM培養3 d。對照組細胞不需要用其他藥物處理，只用1 μmol·L-1胰島素處理。各組細胞培養12 d后，用油紅O溶液染色。首先在室溫條件下，用10%福爾馬林溶液固定細胞1 h，然后用油紅O溶液染色細胞2 h，再用蘇木精-伊紅染色15 min。接著用60%異丙醇溶液清洗細胞3次，以去除未結合細胞的染料。最后，將細胞置于顯微鏡下拍攝圖像(400×)。

3 結果

3.1 建立2型糖尿病小鼠模型期間的小鼠體重變化在造模期間，分別記錄各組小鼠的體重。與空白對照組相比，2型糖尿病模型組小鼠體重有所下降, 但差異并無顯著性。

3.2 環氧澤瀉烯對2型糖尿病小鼠血糖的影響羅格列酮10 mg·kg-1劑量組連續每天給藥1次，與2型糖尿病模型組小鼠相比，d 0(給藥羅格列酮之前)和給予羅格列酮的d 7、14、21的血糖明顯降低。環氧澤瀉烯10 mg·kg-1劑量組比5 mg·kg-1劑量組的降血糖活性稍好，但差異無顯著性(P<0.05)，而20 mg·kg-1劑量組降血糖活性與10 mg·kg-1劑量組相近(Fig 2)。

3.3 環氧澤瀉烯對2型糖尿病小鼠口服葡萄糖耐受試驗的影響為了測定環氧澤瀉烯對葡萄糖耐受和胰島素分泌的影響，對2型糖尿病模型組和藥物組進行了口服葡萄糖耐受試驗。與2型糖尿病模型組相比，每日給予劑量10 mg·kg-1且持續21 d的羅格列酮組于d 22的口服葡萄糖耐受試驗中，第30 min和60 min明顯地降低了小鼠血糖值，每日給予10、20 mg·kg-1且持續21 d的環氧澤瀉烯組于d 22的口服葡萄糖耐受試驗中，第30 min和60 min也體現出降低血糖的趨勢。每日給予5 mg·kg-1環氧澤瀉烯組在持續給藥21 d后，在口服葡萄糖耐受試驗中也體現出降低血糖的活性，但是與2型糖尿病模型組相比，降血糖活性并不明顯(Fig 3)。

Fig 2 Influence of alismoxide on blood

##P<0.01vsblank control group;**P<0.01vstype 2 diabetic model group

Fig 3 Influence of alismoxide on blood

#P<0.05,##P<0.01vsblank control group;*P<0.05vstype 2 diabetic model group

3.4 環氧澤瀉烯對2型糖尿病小鼠體重的影響與2型糖尿病模型組比較，每天灌胃10 mg·kg-1羅格列酮或環氧澤瀉烯并沒有對小鼠體重產生明顯的影響(Fig 4)。

Fig 4 Effect of alismoxide on body

3.5 環氧澤瀉烯對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響如Fig 5所示，與空白對照組和對照組相比，羅格列酮促進了3T3-L1前脂肪細胞分化過程，并呈現濃度依賴趨勢。環氧澤瀉烯(0.5、1 μmol·L-1)也加速了3T3-L1前脂肪細胞分化過程，并且展現出比羅格列酮更強的趨勢。

4 討論

目前，臨床用于血糖控制的口服抗糖尿病西藥均有不同程度的不良反應或副作用[10]，而中藥治療2型糖尿病及其并發癥具有良好的臨床療效和應用前景[11]。據報道，植物多糖、生物堿、黃酮、苷類、肽類等具有降血糖活性[12-13]，但是具體的活性物質及其作用機制尚不明確。因此，從中藥資源中尋找具有明確機制的、安全的活性物質用于防治2型糖尿病迫在眉睫[14]。作者前期研究結果表明，灌胃給予澤瀉乙酸乙酯萃取層不僅能降低2型糖尿病小鼠空腹血糖，而且在口服葡萄糖耐量試驗期間降低血糖[4]，但是具體的有效活性物質還需深入探索。本實驗通過2型糖尿病小鼠模型和3T3-L1前脂肪細胞模型，探索了澤瀉中具有降低血糖活性的有效成分。

通過測定并對比空白對照組和2型糖尿病模型組小鼠血糖值，從而確定2型糖尿病小鼠模型是否建立成功，選擇空腹血糖值高于11.1 mmol·L-1的小鼠作為2型糖尿病模型[15]。結果顯示，2型糖尿病模型組小鼠在腹腔注射煙酰胺和鏈脲佐菌素后的d 21，空腹血糖值均高于11.1 mmol·L-1，且明顯高于空白對照組小鼠血糖值。在口服葡萄糖耐受試驗的0、30、60、120 min，2型糖尿病模型組小鼠血糖值均高于空白對照組，提示2型糖尿病模型組小鼠對胰島素敏感性降低，證明成功建立2型糖尿病模型。

Fig 5 Effect of alismoxide on 3T3-L1 preadipocyte differentiation(×400)

Representative images of Oil Red O-stained pre-adipocytes of blank control group(A), differentiated 3T3-L1 adipocytes in control group(B), and cells treated with 0.5 μmol·L-1rosiglitazone(C), 1 μmol·L-1rosiglitazone(D), 0.5 μmol·L-1alismoxide(E), and 1 μmol·L-1alismoxide(F).

每日按照2型糖尿病小鼠體質量灌胃10 mg·kg-1羅格列酮1次，持續灌胃21 d后的血糖明顯低于d 1灌胃給藥前的血糖值。每日按照2型糖尿病小鼠體重灌胃1次，持續灌胃21 d后的環氧澤瀉烯(5、10、20 mg·kg-1)組的小鼠血糖值均低于d 1灌胃給藥前的血糖值，提示環氧澤瀉烯對2型糖尿病小鼠具有降血糖活性的潛力。

為探索環氧澤瀉烯對胰島素的敏感性，在連續灌胃羅格列酮或環氧澤瀉烯3周后，將小鼠禁食過夜，于d 22進行了口服葡萄糖耐受試驗。在口服葡萄糖耐受試驗過程中，連續21 d每日灌胃給予羅格列酮10 mg·kg-1組、環氧澤瀉烯(10、20 mg·kg-1)組的2型糖尿病小鼠均呈現血糖降低的趨勢，因此推斷環氧澤瀉烯具有類似羅格列酮降血糖的活性。脂肪細胞油紅O染色結果顯示，在0.5、1 μmol·L-1濃度下，環氧澤瀉烯促進3T3-L1前脂肪分化，這可能有利于增強胰島素的敏感性，但需實驗進一步驗證。

本實驗探索了環氧澤瀉烯對空腹血糖值、口服葡萄糖耐受試驗過程中血糖值、3T3-L1前脂肪分化過程的影響，提示環氧澤瀉烯具有降血糖的潛力，促進脂肪分化，但其具體作用機制需要深入研究。