介導缺氧誘導因子-1α表達的相關信號通路在類風濕性關節炎中的研究進展

孫明慧，吳 虹，卜妍紅，張 衡，戴學靜，王 言，占 翔

(安徽中醫藥大學藥學院，新安醫學教育部重點實驗室，中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的、以慢性滑膜炎癥為臨床表征的自身免疫性疾病，其病理特征是滑膜組織異常炎性增生、血管新生、血管翳形成、關節軟骨和骨的不可逆性破壞，甚至引發畸形病變以及嚴重的并發癥[1]。迄今為止，RA病因尚未明確，但已有研究表明，缺氧微環境作為RA滑膜炎癥組織的重要特征之一，參與調節滑膜炎癥反應、血管新生和軟骨破壞等關鍵病理生理過程[2]。

缺氧能促進炎性因子的釋放，加重炎癥反應；反之，炎癥也能加重組織缺氧。缺氧誘導因子1α (hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是調節細胞對缺氧反應的核轉錄因子，在缺氧微環境中，HIF-1α水平明顯上升，并調節胞內許多基因的轉錄與表達。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最具特征性的HIF-1α下游靶基因之一，缺氧導致HIF-1α積累，并觸發HIF-1α和VEGF途徑的正反饋調節，促使血管生成以改善機體低氧環境，而降低HIF-1α水平可通過VEGF依賴機制抑制血管生成[3-4]。HIF-1α還參與誘導基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的分泌，調控RA成纖維滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLSs)的遷移和侵襲機制，阻斷HIF-1α表達可抑制缺氧誘導的RA-FLSs遷移和侵襲，改善滑膜增生及軟骨和骨破壞[4-5]。

隨著細胞信號轉導通路地深入研究，越來越多RA病理調節機制被發現。目前，除氧感受器通路脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylases，PHDs)-HIFs-pVHL外，已發現調控HIF-1α表達的信號通路還包括PI3K/Akt、Ras-Raf-MEK-ERK、JAK/STAT、NF-κB等，這些細胞信號轉導通路中的效應蛋白有望成為治療RA潛在的作用靶點。鑒于HIF-1α對RA病情的推動作用，筆者對調控HIF-1α表達的信號通路進行綜述，以期從改善病情角度為RA治療及抗RA新藥研發提供思路。

1 PHDs/HIF-1α/pVHL通路

PHDs屬于氧依賴性羥化酶，包括3個亞型：PHD1～3，其活性隨著細胞內氧含量的變化而變化，對HIF-1α的穩定性調控起關鍵作用。HIF-1α含有1個氧依賴性的降解結構域(oxygen dependent degradation domain，ODDD)，在常氧條件下，該結構域中的脯氨酸殘基Pro402和Pro564極易被氧敏感的PHDs羥基化，并與腫瘤抑制蛋白pVHL結合，聚集多種泛素蛋白(ubiquitin，Ub)，組成泛素蛋白酶復合體，HIF-1α被蛋白酶體快速降解。除PHDs之外，天冬酰胺羥化酶作為HIF-1抑制因子(factor-inhibiting HIF-1，FIH-1)，可將HIF-1α亞基C-末端反式激活結構域(transactivation domain，TAD)中的天冬酰胺殘基Asn803羥基化，干擾其與輔因子p300/CBP的結合。在低氧條件下，PHDs和FIH-1活性迅速降低，導致HIF-1α在細胞質中降解受阻，并大量聚集、積累并活化，繼而轉移至細胞核內，與結構亞基HIF-1β及輔因子p300/CBP發生聚合，形成HIF-1α復合物。該復合物與特定的DNA序列結合，進而與靶基因上的缺氧反應元件(hypoxia-responsive elements，HREs)結合，調控下游靶基因的激活和轉錄。缺氧引起的氧感受通路的異?；罨赗A病程中發揮重要作用(Fig 1)[6]。

在RA關節缺氧環境中，氧依賴性羥化酶在FLSs中短暫沉默，進而上調HIF-1α的水平，誘導許多促血管生成因子和炎癥介質的表達。Muz等[7]發現，沉默PHD1或FIH-1后，HIF-1α水平無影響，而沉默PHD2可增強HIF-1α的穩定性，誘導下游多種靶基因的表達(包括促血管生成基因等)，表明PHD2是調節RA-FLSs中PHDs/HIF-1α/pVHL通路的關鍵參與者。對比缺氧條件下HIF-1α與促血管生成基因的表達水平發現，PHD2沉默引起的變化與缺氧條件非常相似，意味著PHD2的缺失可以模擬缺氧環境，但在正?；ぜ毎校聊琍HD2不影響HIF-1α的穩定性，其具體調控機制仍需進一步研究。結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)屬于富含半胱氨酸生長因子家族的一員，其作為一種炎性介質在RA中高表達，CTGF的水平與VEGF表達呈正相關。進一步研究發現，CTGF可通過上調microRNA-210的水平，抑制甘油-3-磷酸脫氫酶1樣蛋白(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1-like，GPD1L)表達，導致PHD活性降低，HIF-1α積累，進而上調VEGF mRNA水平及VEGF的表達，促進血管生成[8]。

Fig 1 Mechanism of PHDs/HIF-1α/pVHL signaling

Under normoxic conditions, PHDs and FIH hydroxylate different sites of HIF-1α, respectively, producing pVHL binding sites, blocking the combination with cofactor p300/CBP, and resulting in HIF-1α degradation. Under hypoxic conditions, the activity of PHDs and FIH decreased, HIF-1α accumulates and migrates into the nucleus to form a complex with HIF-1β and p300/CBP. The complex combines with HRE to induce target gene transcription, and then regulates cell proliferation, migration/invasion, apoptosis and angiogenesis.

2 PI3K/Akt信號轉導通路

磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)，屬于胞內磷脂酰肌醇激酶，是細胞中重要的信號調節蛋白，其同時具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶和磷脂酰肌醇激酶的活性。PI3K分為結構與功能各異的3型，其中I型PI3K研究最廣泛，由催化亞基p110和調節亞基p85構成。Akt作為PI3K下游主要的效應分子之一，也是一類特異性的Ser/Thr蛋白激酶。PI3K/Akt信號轉導通路在滑膜細胞增殖和凋亡失衡中發揮關鍵作用，其異?；罨鸹み^度增生并向軟骨和骨組織浸潤生長，誘導血管新生及血管翳形成，導致關節畸形和骨破壞[9-10]。

許多信號蛋白分子和信號傳導復合物都能啟始PI3K的激活過程，誘發磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol diphosphate，PIP2)磷酸化，產生第二信使三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol triphosphate，PIP3)，PIP3與存在PH結構域的蛋白激酶Akt相互作用，導致Akt構型改變，形成Ser473和Thr308的磷酸化位點，并移位至細胞膜。同樣存在PH結構域的3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(3-phosphoinositide dependent protein kinase-1，PDK1)與哺乳動物雷帕霉素靶復合體2(mammalian target of rapamycin complex 2，mTORC2)分別將Akt上的Ser473和Thr308位點磷酸化，致使Akt被激活(Fig 2)。

哺乳動物雷帕霉素靶向蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是PI3K/Akt信號通路的下游效應分子之一。張曉軍等[11]采用弗氏完全佐劑建立佐劑性關節炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型，采用ELISA法檢測大鼠血清中HIF-1α、VEGF的表達，Western blot檢測滑膜組織PI3K、Akt1、p-Akt1、mTOR蛋白表達情況發現，與正常組比較，模型組血清VEGF、HIF-1α和滑膜組織PI3K、Akt1、p-Akt1、mTOR表達明顯升高，表明活化的PI3K/Akt/mTOR信號轉導途徑可能參與誘導滑膜血管新生。Zhang等[12]探討低氧條件下RA-FLSs活性、細胞凋亡和侵襲性的影響發現，與常氧細胞相比，缺氧RA-FLSs侵襲性明顯增強，且其侵襲能力與HIF-1α表達水平呈正相關。曲古抑菌素A可明顯抑制缺氧誘導RA-FLSs的活力，誘導細胞凋亡，阻斷RA-FLSs侵襲，并降低MMP-2、MMP-9的表達。進一步對其作用機制進行探究發現，這些作用通過下調PI3K活性，進而抑制Akt活化實現，而活性Akt的過表達可逆轉其對RA-FLSs侵襲性及MMP-2、MMP-9下調的抑制作用，表明缺氧誘導的RA-FLSs中的促凋亡與抗侵襲活性與PI3K/Akt信號轉導的激活有關。

3 Ras/Raf/MEK/ERK信號轉導通路

作為MAPKs的一個亞族，胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)包括5個亞型，即ERK1～ERK5，其中對ERK1/2研究最為廣泛。在炎性環境中，許多細胞因子參與啟始Ras/Raf/MEK/ERK信號轉導通路，通過一系列復雜過程被細胞表面受體和胞內傳感機制活化，參與多種生物學反應。ERK的異?；罨閷A中細胞增殖和炎癥反應之外，還參與調控血管生成、軟骨及骨破壞等過程，導致RA病情不斷惡化[13]。

多數信號因子對ERK1/2的活化都始于對Ras的激活，Ras是信號傳遞的“分子開關”，其被激活后作用于Raf的氨基末端，使Raf從胞質移位至細胞膜上，通過絲/蘇氨酸殘基磷酸化而活化。Raf激活后，其C端催化區可與MEK結合，并使兩個絲氨酸磷酸化，進而激活MEK，隨后通過酪氨酸和蘇氨酸雙特異性磷酸化激活ERK，形成Ras/Raf/MEK/ERK途徑(Fig 2)。

研究證實，炎癥因子、生長因子和某些細胞因子受體均可激活ERK信號轉導通路，B細胞活化因子(B-cell activating factor，BAFF)屬于腫瘤壞死因子超家族成員之一，在B細胞的成熟和維持中起作用，且BAFF與自身免疫疾病密切相關。Lee等[14]探究了TNF-α誘導的BAFF表達對RA-FLSs和人類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞MH7A存活的影響，通過使用BAFF siRNA轉染細胞，證實BAFF表達與細胞存活率呈正相關。常氧條件下，TNF-α誘導的MH7A細胞BAFF、VEGF和HIF-1α的轉錄及表達可被HIF-1α siRNA阻斷；缺氧條件下或過表達HIF-1α時，HIF-1α siRNA阻斷作用被逆轉。進一步研究發現，ERK抑制劑PD98059抑制TNF-α誘導的BAFF表達，而HIF-1α的過表達可使PD98059抑制作用被逆轉，表明TNF-α通過ERK依賴的HIF-1α表達來調控FLSs的存活。ERK的激活還參與調節血管新生，來源于三七葉片的三七皂苷Ft1可通過激活ERK信號通路，誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)增殖、遷移，誘導管形成。對其具體機制探究發現，Ft1刺激Raf/MEK/ERK途徑磷酸化，促進HIF-1α從胞質向胞核的轉運及HIF-1α與VEGF啟動子的結合，上調VEGF mRNA的轉錄水平及VEGF的分泌。Ft1也參與調控PI3K/Akt/mTOR途徑磷酸化。進一步研究發現，mTOR及其效應器核糖體40S小亞基S6蛋白激酶(P70S6K)是PI3K/Akt和Raf/MEK/ERK的下游靶點，沉默mTOR致使Ft1的促血管生成作用被抑制，表明PI3K/Akt和Raf/MEK/ERK通路均通過下游mTOR/P70S6K途徑，調控HIF-1α的活化及VEGF的轉錄與表達[15]。

Fig 2 Mechanism of signaling pathways regulating HIF-1α mRNA and protein expression

Inflammatory factors activate PI3K and induce PIP3production. Under the effect of PKD1 and mTORC2, Akt is phosphorylated and activated. After inflammatory factors stimulated Ras, Raf/MEK phosphorylate and finally activate ERK. Both activated Akt and ERK can phosphorylate mTOR and activate its effector protein p70S6K, increasing the translation level of HIF-1α.

Inflammatory factors bind to its receptors on the membrane and then activate the JAK/STAT signaling pathway. The activated STAT proteins are translocated into the nucleus to bind to the target genes in the form of a dimer, thus affecting the synthesis of HIF-1α mRNA. Inflammatory factors activate IKK which degrades IκB, and resulting in activated NF-κB releases. Activated NF-κB transports into the nucleus and binds to target gene, finally induces the synthesis of HIF-1α mRNA.

4 JAK/STAT信號轉導通路

JAK屬于典型的非跨膜酪氨酸激酶，JAK家族由4個成員組成，分別是JAK1-JAK3以及Tyk2，其可使與其相結合的細胞因子受體磷酸化，它還能夠使含有SH2結構域的蛋白分子發生磷酸化反應。STAT被稱為“信號轉導子和轉錄激活子”，目前為止已發現STAT家族的7個成員，STAT蛋白包含6個功能區段，其中SH2結構域是最重要的功能區段，可與細胞因子受體酪氨酸磷酸化特異性結合。目前，大量的研究表明JAK/STAT信號通路功能失調可誘導RA-FLSs增殖，導致滑膜增生；調節免疫反應，造成滑膜炎癥；調控靶基因MMPs的分泌，加重軟骨及骨破壞[16]。

JAK-STAT信號轉導通路通常由諸多細胞因子激活，介導細胞多種生物學功能，在免疫調節和炎癥反應過程中發揮關鍵作用。首先，信號分子作用于相應的受體后，與受體偶合的JAK激酶發生酪氨酸磷酸化作用并被活化。然后，活化的JAK促使受體發生磷酸化修飾，產生酪氨酸磷酸化位點；同時，含有SH2結構域的STAT蛋白被募集至該位點，經JAK催化磷酸化修飾后，磷酸化的STAT蛋白以二聚體形式移位至細胞核內，與靶基因結合并誘導其轉錄與翻譯(Fig 2)。

為探討低氧對RA中STAT3誘導的促炎途徑的影響，甄曉洲等[17]通過建立低氧誘導的THP-1細胞的炎癥模型發現，低氧可促進炎癥因子IL-18、TNF-α的分泌，并提高細胞內p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達。JAK2抑制劑AG490能明顯抑制低氧誘導的p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達，降低促炎因子IL-18、TNF-α的分泌。即低氧可能通過激活JAK2/STAT3信號通路，誘導細胞炎癥因子的表達增加，加重炎癥反應。Gao等[18]研究發現，缺氧誘導滑膜組織HIF-1α與p-STAT1/3的表達，并促進p-STAT3核易位，該效應可被STAT3 siRNA和JAK2抑制劑WP1066阻斷；且缺氧誘導的細胞侵襲、遷移和細胞因子產生受到STAT3 siRNA和WP1066的抑制。HIF-1α siRNA可降低缺氧誘導的p-STAT3水平，STAT3 siRNA也能抑制缺氧誘導的HIF-1α表達水平，表明在RA促炎機制的調節中，HIF-1α和STAT3信號之間存在功能聯系；在體外RA滑膜移植培養中，JAK2抑制劑明顯降低IL-6、IL-8和MMP3的自分泌，并誘導IL-10表達，進一步證實STAT阻斷在RA治療中的作用。目前，JAK/STAT信號途徑對RA中HIF-1α表達的研究尚不多見，但在許多癌癥發病機制中已進行了深入探討，JAK/STAT信號途徑的激活是通過上調HIF-1α mRNA及其蛋白的表達，抑制癌細胞凋亡、促進腫瘤血管新生以及癌細胞侵襲和轉移等過程。所以我們有理由推斷，在RA中，JAK/STAT信號途徑亦能調控HIF-1α mRNA的表達，該機制具體途徑有待進一步研究。

5 NF-κB信號轉導通路

NF-κB是哺乳動物中一類關鍵的轉錄激活因子，NF-κB家族由NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)、RelA(p65)、RelB和cRel組成，其N端均存在Rel同源區，可與DNA結合，并特異性識別DNA堿基序列；RelA(p65)、c-Rel和RelB三者C端存在反式激活結構域，能獨立誘導基因表達。NF-κB常以p65/p50二聚體形式存在。NF-κB的活化可誘導炎性介質持續作用，在細胞分化、凋亡、黏附、炎癥及免疫應答等方面影響RA的發生、發展[19]。

靜息狀態時，抑制蛋白IκB可通過其C端特定的錨蛋白重復序列結合，并封閉NF-κB蛋白的核定位區域(nuclear-localization sequence，NLS)，抑制NF-κB的活性。在經典途徑中，NF-κB的活性受IκB激酶(IκB kinase, IKK)的控制，該激酶介導IκB磷酸化并降解，誘導NF-κB的核轉位(Fig 2)。缺氧對RA-FLSs中NF-κB活化的影響機制尚不清楚，但在其他細胞的研究中發現，常氧條件下，IKK可被PHDs羥基化失活，抑制NF-κB的活化；在缺氧條件下，PHDs對IKK的羥化活性降低，導致IκB磷酸化并降解，進而緩解NF-κB的抑制作用[20]。

炎癥可激活NF-κB信號轉導途徑，進而上調多種促炎因子釋放，導致慢性、持續性的炎癥反應，進而加重滑膜炎癥，促進軟骨和骨破壞以及血管翳生成。Trebec-Reynolds等[21]發現，經NF-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)處理后，巨型破骨細胞中HIF-1α mRNA及蛋白表達增加，VEGF-A表達水平升高。二甲基雙酚A作為有效的HIF-1α抑制劑，可明顯降低巨型破骨細胞中的VEGF-A蛋白水平；NF-κB抑制劑膠酶毒素明顯抑制RANKL誘導的HIF-1α mRNA及蛋白表達，表明RANKL通過激活NF-κB途徑，提高HIF-1α mRNA及蛋白水平，高水平的HIF-1α促進VEGF表達，進而促進血管新生和骨重建循環，加重RA病情。高遷移率族蛋白1(high mobility group protein 1，HMGB1)是一種由滑膜組織中多種免疫細胞和滑膜細胞共同釋放的促炎介質，Park等[22]發現，HMGB1可增強RA患者關節滑膜細胞中HIF-1α mRNA的轉錄水平和活性，并刺激VEGF的表達；用抗HMGB1抗體干預其作用可抑制血管新生，并降低HIF-1α的表達，降低HIF-1α水平可抑制HMGB1誘導的VEGF表達。進一步研究發現，HMGB1受體TLR4參與HMGB1誘導的HIF-1α表達，且與NF-κB的轉錄活性有關，抗TLR4抗體明顯抑制HMGB1誘導的NF-κB p65的活性，抑制NF-κB激活可阻斷HMGB1依賴的HIF-1α mRNA的表達及其活性的上調，提示NF-κB調控參與了HIF-1α基因的轉錄與表達。

6 其他信號轉導通路

Notch信號通路由Notch受體、Notch配體及細胞內效應器分子CSL(CBF-1, Suppressor of hairless, Lag)蛋白三部分組成。Notch信號的產生通常來源于相鄰細胞Notch配體與受體的相互作用，繼而釋放出有活性的Notch蛋白NICD(Notch intracellular domain, 又稱ICN)，NICD易位至細胞核內與CSL蛋白相結合，并招募核轉錄激活蛋白家族MAML(mastermind-like)，繼而形成三元絡合轉錄復合物，其作用于Notch信號通路的相應靶點基因，發揮多種生物學作用。Gao等[23]研究發現，Notch配體DLL4、Jagged-1與NICD在RA滑膜組織中表達增加，且滑膜組織氧含量與患者滑膜組織中NICD的表達呈負相關；Notch抑制劑DAPT可以抑制HIF-1α的表達及活化，進而抑制血管新生。缺氧條件下，Notch-1還與STAT3信號之間存在功能聯系，缺氧誘導的Notch-1IC、DLL4和靶基因HRT-1、HRT-2的表達均可被JAK2抑制劑WP1066抑制，即通過阻斷STAT信號傳導，抑制Notch信號途徑的激活，進而調節RA促炎機制，達到治療RA的目的[18]。

1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)是一種生物活性脂質，由鞘氨醇(sphingosin，Sph)經鞘氨醇激酶(sphingosine kinases，SphKs)磷酸化產生，可與細胞膜表面G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)家族成員S1P受體(S1P receptors，S1PRs)結合，S1PRs通過調節相關炎癥信號通路，影響新生血管的形成[24]。Sassoli等[25]對骨髓間充質基質細胞研究發現，S1P/S1PR1介導缺氧狀態下MMP-2與HIF-1α的表達，S1PR1拮抗劑降低HIF-1α表達及其核定位，表明S1PR1介導的信號傳導可能維持HIF-1α在缺氧條件下的表達及活性。

7 展望

通過對介導HIF-1α表達的相關信號通路的調研發現，HIF-1α水平及其介導的促炎、促血管新生等作用是一個受多機制、多信號通路調控的過程，且各通路之間相互交錯，關聯錯綜復雜。通過調節介導HIF-1α表達的多種信號途徑，可為RA治療提供新的方向。目前，已研究發現多種信號通路抑制劑如托法替尼(JAK抑制劑)、替西羅莫司(mTOR抑制劑)、貝伐單抗(抗VEGF抗體)等，參與抑制細胞增殖和存活，抑制炎癥反應、血管生成、炎性細胞浸潤和關節損傷等過程[20]。因此，從信號通路途徑深入研究RA的發病機制，發掘信號通路中的關鍵環節和關鍵因子，并篩選其特異性阻滯劑阻斷信號傳遞，以期為RA治療和抗RA新藥的研發開拓新思路。