高效液相色譜法同時測定復方水楊酸硫乳膏中水楊酸和醋酸氯己定含量

彭賢東，王婭俐，王 丹，潘良平，唐志立

（四川省南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床醫學院藥學部，四川 南充 637000）

復方水楊酸硫乳膏是自制醫療機構制劑（川藥制字H20080472），主要成分為水楊酸、升華硫和醋酸氯己定，用于體癬、頭癬、脂溢性皮炎及疥瘡療效顯著。水楊酸具有促進表皮角質層正常化、改善表皮通透屏障功能[1]和抗真菌、止癢、溶解角質的作用；醋酸氯己定是常用皮膚黏膜消毒劑，在有效濃度下部分葡萄球菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、大腸埃希菌、丙酸桿菌等對其敏感[2]，具有強抗菌作用；升華硫具有殺疥蟲、殺真菌作用，能去除油脂，并可促進角質溶解。原四川省食品藥品監督管理局注冊質量標準中采用了酸堿中和滴定法測定水楊酸的含量，并未對醋酸氯己定進行含量控制。水楊酸的含量測定方法有酸堿中和滴定法、紫外分光光度法[3]、高效液相色譜（HPLC）法[4]等。由于乳膏基質為酸性，因此酸堿中和滴定法測定乳膏中水楊酸的含量偏高；其基質又有紫外吸收，因此用紫外分光光度法直接測定水楊酸的含量會影響結果的準確性。醋酸氯己定的含量測定方法有滴定分析法、紫外分光光度法[5-6]、HPLC法[7-9]等。為了更好地控制該制劑的質量，本研究中采用HPLC法同時測定復方水楊酸硫乳膏中水楊酸和醋酸氯己定的含量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀，UV-1800型紫外-可見分光光度儀（日本島津公司）；BP211D型電子分析天平（德國賽多利斯股份公司）；pHS-3C型pH計（上海雷磁儀器廠）。

1.2 試藥

復方水楊酸硫乳膏（南充市中心醫院，批號為180122，180123，180124，規格為每 1 g 含水楊酸 10 mg、升華硫100 mg、醋酸氯己定0.5 mg）；水楊酸對照品（批號為 100106-201605，含量 99.7%），醋酸氯己定對照品（批號為 100183-201604，含量 96.9%），均由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Atlantis C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：水（乙酸銨 26 g和三乙胺 37 mL，加水至1 000 mL，并用冰醋酸調 pH 至 4.0）-甲醇（50∶50，V／V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：257 nm；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。理論板數按水楊酸峰、醋酸氯己定峰計算均應不低于3 000。

2.2 溶液制備

取水楊酸對照品 200.46 mg、醋酸氯己定對照品10.32 mg，精密稱定，置同一 100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得含水楊酸、醋酸氯己定成分的對照品貯備液；精密量取上述貯備液7.5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液（質量濃度為 0.299 8 g／L的水楊酸和0.015 0 g／L 的醋酸氯己定）。取本品 3 g（約含水楊酸30 mg，醋酸氯己定 1.5 mg），精密稱定，置 100 mL 容量瓶中，加甲醇適量，于50℃水浴中加熱并時時振搖，使乳膏充分分散，水楊酸和醋酸氯己定溶解，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，濾過，棄去初濾液，取續濾液，即得供試品溶液。按處方比例制備不水楊酸和醋酸氯己定的陰性對照品，按供試品溶液制備方法制備，即得陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：吸取2.2項下3種溶液各10 μL，分別按上述色譜條件測定，記錄色譜峰。結果水楊酸、醋酸氯己定的保留時間分別約為4.4 min和14.7 min，理論板數按醋酸氯己定峰計算為3 479，樣品中水楊酸與醋酸氯己定分離完全，與其他組分分離良好，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

線性關系考察：精密量取對照品貯備液，加甲醇分別稀釋成含水楊酸、醋酸氯己定質量濃度分別為0.099 9，0.1999，0.2998，0.3997，0.4996，0.5996g／L 和 0.005 0，0.010 0，0.015 0，0.020 0，0.025 0，0.030 0 g ／L 的溶液，進樣 10 μL，依法測定。以質量濃度（C）為橫坐標、峰面積積分值（A）為縱坐標繪制標準曲線，得水楊酸、醋酸氯己定回歸方程分別為 A水＝1.92×106C水＋3333.1(r＝0.999 9，n＝6）和 A醋＝2.43×107C醋＋2 866.7(r＝0.999 9，n ＝6）。結果表明，水楊酸、醋酸氯己定檢測質量濃度的線性范圍分別為 0.099 9～0.599 6 g／L 和0.0050 ～0.0300 g ／L。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗：取同一對照品溶液，按擬訂色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積。結果水楊酸、醋酸氯己定峰面積的 RSD 分別為 0.55% 和 0.82% （n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為180122）6份各3 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，進樣 10 μL，記錄峰面積。結果水楊酸、醋酸氯己定含量的 RSD分別為0.67% 和 0.70%（n ＝6），表明方法重復性較好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液（批號為180122），分別于 0，2，4，6，8，12 h 時進樣 10 μL，記錄峰面積。結果水楊酸、醋酸氯己定峰面積 RSD分別為0.84%和1.00%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內穩定。

回收試驗：根據處方工藝，稱取陰性對照品適量，分別加入水楊酸和醋酸氯己定對照品，制成相當于標示量80%，100%，120%的模擬樣品，依法制備供試品溶液，每種質量濃度制備3份，進樣10 μL，記錄峰面積，計算回收率。結果見表1。

表1 回收試驗結果（n＝9）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液并進樣測定，結果見表2。

表2 3批樣品含量測定結果（%，n＝3）

3 討論

3.1 流動相選擇

曾考察甲醇 -水 -冰醋酸（50∶50∶1，V／V／V）、磷酸二氫鉀 -甲醇（70∶30，V／V）、磷酸二氫鉀 -乙腈（65 ∶35，V／V），發現醋酸氯己定均不能很好地出峰，最終選擇本流動相。考察了甲醇 -水（55∶45，V／V），發現溶劑峰與水楊酸峰分離度小，因此調高水相比例[甲醇-水（50∶50，V／V）]使水楊酸保留時間延長，基質峰與水楊酸和醋酸氯己定峰分離較好，保留時間恰當。

3.2 檢測波長選擇

分別配制10 μg／mL的水楊酸和醋酸氯己定甲醇溶液，在200～400 nm波長范圍內紫外掃描，結果水楊酸在234.1 nm和303.9 nm波長處有最大吸收，醋酸氯己定在257.8 nm波長處有最大吸收。因復方水楊酸硫乳膏中醋酸氯己定的含量只有水楊酸含量的1／20，水楊酸在257 nm波長處也有一定的吸收，且2種成分峰面積均較適宜，峰形好，故選擇257 nm作為檢測波長。

3.3 pH 選擇

水楊酸酸性較弱，因為其鄰位羥基對羧基的影響，互相容易形成分子內氫鍵，使得氫原子解離成質子[10]，因而其在水中會發生電離，從而會產生拖尾。為了使水楊酸盡可能以分子形式存在，擬采用冰醋酸來進行調節，從而抑制水楊酸的解離。當pH調節為4時，可很好地抑制水楊酸的解離，減少拖尾現象，得到了滿意的峰形。