川芎嗪防護嚴重燒傷大鼠急性肺損傷及對NF- B／NLRP3信號通路的影響

劉馳星，何樹清 ，詹劍華

（1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊908醫(yī)院，江西 南昌 330002； 2.南昌大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330002）

急性肺損傷（ALI）及其所引發(fā)急性呼吸窘迫綜合征是廣泛性皮膚燒傷患者高發(fā)病率和高死亡率的主要原因，臨床表現(xiàn)為低氧血癥、非心源性肺水腫和急性呼吸衰竭。嚴重燒傷所致的ALI延遲復蘇被認為是對肺的間接（繼發(fā)）損傷且與急性全身炎性反應(yīng)綜合征相關(guān)[1-3]。嚴重的燒傷和復蘇延遲可引發(fā)過度的炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為局部和全身炎性介質(zhì)過表達。核因子κB（NF-κB）的激活可調(diào)節(jié)一系列基因表達，以及腫瘤壞死因子-α（TNF- α）、白細胞介素 2（IL-2）、白細胞介素 6（IL-6），均可導致肺組織損傷[4-5]。NLRP3是一種由Nod樣受體（NLR）家族組成的多蛋白復合物，在ALI中起重要作用。NLRP3炎性體由NLRP3、ASC和半胱天冬酶-1組成，其激活可誘導IL-1β的成熟和分泌。因此，抑制NF-κB和NLRP3炎性體的活性可抑制由嚴重燒傷誘導的肺組織的炎性反應(yīng)[6-7]。川芎嗪來源于草藥川芎，具有抗炎、抗癌作用，可改善肺癌患者胸腔積液[8-9]，抑制人表皮角質(zhì)形成細胞的炎性反應(yīng)。本研究中擬探討川芎嗪對嚴重燒傷大鼠ALI防護作用及NF-κB／NLRP3信號通路的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

Sprague-Dawley大鼠 60只，6～8周齡，體質(zhì)量250～300 g，由山東大學醫(yī)學院動物實驗中心提供（許可證號為SCXK＜魯＞20001003）；本研究方案經(jīng)醫(yī)院動物研究委員會批準，符合美國國立衛(wèi)生研究院動物使用和護理指南。動物隨意獲取食物和水，自動控制晝夜循環(huán)（12 h ／12 h），室溫（22 ± 1）℃ 。將大鼠隨機分為對照組、模型組、川芎嗪組，每組20只，雌雄各半。

1.2 方法

使用具有圓形開口的木板暴露大鼠30%的總體表面積。通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉（劑量為30 mg／kg）麻醉后，夾住模型組、川芎嗪組大鼠的背毛，使其仰臥在裝置上。將具有木制裝置的大鼠背部區(qū)域浸入熱水（100℃）中15 s，產(chǎn)生全層皮膚燒傷；通過組織學驗證燒傷創(chuàng)面深度；燒傷后4 h通過腹膜內(nèi)注射每1 kg體質(zhì)量4 mL體內(nèi)表面積的乳酸林格溶液復蘇。大鼠皮下注射丁丙諾啡0.25 mg／kg，并單獨用籠子飼養(yǎng)。川芎嗪組在燒傷后立即予大鼠腹膜內(nèi)注射50000U／kg注射用鹽酸川芎嗪（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H20041171，規(guī)格為每支40 mg）。模型組大鼠僅接受較少量的載體（0.9%氯化鈉注射液，USP標準品，上?，F(xiàn)代哈森＜商丘＞藥業(yè)有限公司）。對照組采用37℃溫水予相同程序和復蘇。

1.3 指標測定

濕肺／體質(zhì)量及肺損傷評分：試驗結(jié)束后（6 h后），頸椎脫臼處死大鼠，取右肺組織，測定濕肺／體質(zhì)量。隨后取右側(cè)部分肺組織，行常規(guī)染色切片，鏡下閱片，對肺泡內(nèi)充血、肺間質(zhì)水腫、中性粒細胞浸潤、肺泡水腫進行評分。極重度改變?yōu)?分、重度改變?yōu)?分、中度改變?yōu)?分、輕度改變?yōu)?分、無改變或非常輕微為0分，上述4項總分即為肺損傷評分。燒傷后6 h，收集3組大鼠外周動脈血樣品，使用GEM Premier 3000型血氣分析儀（Instrumentation Laboratory，Breda，The Netherlands）分析動脈氧分壓（PaO2）。

大鼠肺組織NF-κB mRNA及NLRP3 mRNA表達水平：使用 RNeasy 試劑盒（Qiagen，Valencia，CA）從肺組織中分離總 RNA，測定其濃度和純度，使用 Access RT-PCR 系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA）進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。參照 GenBank數(shù)據(jù)獲取 2個基因位點的序列，設(shè)計待測基因位點的PCR擴增引物和單堿基延伸引物，使用One Step Prime Script miRNA cDNA合成試劑盒（TaKaRa）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用 SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa）進行定量實時PCR 使 用 引 物 。 NF-κB， 正 向 5′-CCGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCA-3，反向 5′-TCCTTAGGGCA AGGGCTCTTGATGG-3′；NLRP3，正向 5′-GAATGACCTGTTCTTTGA GGCTGAC-3；GAPDH用作管家基因：正向 5′-CACGGCAAGTTCAACGGCACAGTCA-3，反向5′-GATACATTGGGGGTAGGAACACGGA-3。反應(yīng)體系為，正向引物 10 μL，反向引物 10 μL，RNA 模版 0.6 μL，超級酶混合物 0.2 μL，2×μByr一步法 RT-qPCR 緩沖液 5 μL，去 RNA 水 3.4 μL；PCR 程序，95 ℃ 下，初始變性 5 min；95 ℃ 下，熔化 30 s；60 ℃ 下，退火 40 s；在72℃下，伸長 1 min；在 10℃下，最終伸長10個循環(huán)；72 ℃ 下 2 min，保持在 4 ℃ 。通過 2-ΔΔCT方法計算NF-κB和NLRP3相對表達水平。

大鼠肺部組織NF-κB和NLRP3蛋白表達水平：免疫組化法測定NF-κB和NLRP3蛋白在大鼠肺部組織的表達，石蠟包埋的肺組織切片用1%H2O2處理，以抑制內(nèi)部過氧化物酶，并與牛血清預孵育以阻斷非特異性結(jié)合。切片與 NF-κB和 NLRP3一抗（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz）孵育，4 ℃過夜。將生物素化的二抗（ProSci，Poway，CA）應(yīng)用于樣品 1 h。ABC 試劑盒（Vector Laboratories，Burlingame，CA）和 3，3′- 二氨基聯(lián)苯胺用于顯色。隨機選擇圖像并使用TE300型顯微鏡（日本尼康公司）捕獲。隨機選取5個高倍視野（×400）計數(shù)，設(shè)立陰性對照（用PBS來替代一抗體，染色結(jié)果作為陰性，排除染色過程中非特異染色和交叉反應(yīng)所造成的假陽性結(jié)果）和陽性對照（用Dako公司生產(chǎn)的一抗作為陽性對照，染色結(jié)果作為標準結(jié)果）。采用雙盲法統(tǒng)計結(jié)果，評分標準，0 分（0），1 分（0～10% ），2 分（10～50%）和 3分（＞50%）。強度評分，0分（陰性染色），1分（弱染色），2分（中度染色）和 3分（強烈染色）。通過將陽性比例得分乘以染色強度得分來計算NF-κB和NLRP3表達的最終得分，范圍為0～9分。

大鼠肺組織中 IL-2，IL-6，TNF-α蛋白表達水平：按照無菌條件操作，稱取0.1 g肺組織，加入少量液氮，在研缽中迅速將肺組織碾碎至粉末狀；將組織粉末轉(zhuǎn)入 2 mL Eppendorf管中，加入 1.2 mL PBS（pH ＝7.4），充分振蕩混勻，2 000 g，4℃，離心20 min。仔細收集上清液，獲取肺組織勻漿后，采用ELISA法檢測肺組織中IL-2，IL-6，TNF-α 蛋白表達水平。

表1 各組大鼠觀察指標比較（X±s，n＝20）

圖1 各組大鼠右側(cè)肺組織HE、NF- B表達、NLRP3表達染色圖（×400）

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以 X±s表示，多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準 α＝0.05，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

結(jié)果見表1和圖1。由圖1 A可見，對照組大鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)正常，無炎性細胞浸潤、無膠原蛋白沉淀；模型組大鼠肺泡壁明顯增厚、破裂，可見中性粒細胞及少量嗜酸性粒細胞浸潤，肺間質(zhì)可見較多膠原蛋白沉淀；川芎嗪組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，有少量中性粒細胞浸潤，幾乎無膠原蛋白沉淀。采用免疫組化法，NF-κB和NLRP3主要定位于胞質(zhì)，其陽性表達為棕褐色。

3 討論

肺部通常是燒傷后損傷的第1個器官，即使沒有吸入性損傷和感染，也會繼發(fā)ALI。此外，肺功能的損害如炎性反應(yīng)和嚴重的低氧血癥，會損害其他器官和組織，從而導致多器官功能障礙綜合征的進展。因此，鑒定燒傷誘導ALI的早期介質(zhì)及其潛在的分子機制至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，川芎嗪組濕肺／體質(zhì)量比值、肺損傷評分明顯降低，PaO2水平明顯升高；對照組肺泡組織結(jié)構(gòu)正常，無炎性細胞浸潤、無膠原蛋白沉淀；川芎嗪組肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，有少量中性粒細胞浸潤，幾乎無膠原蛋白沉淀。這表明川芎嗪對嚴重燒傷誘導大鼠ALI具有保護作用，濕肺／體質(zhì)量比值、肺損傷評分均明顯降低，PaO2水平明顯升高，炎性細胞因子減少，纖維蛋白原和炎性細胞浸潤減輕。

NF-κB是參與炎性反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，可誘導大量炎性細胞的表達，在損傷后作為炎癥的早期內(nèi)源性警報細胞外釋放，較其他促炎細胞因子早釋放，并作為膿毒癥的“早期介質(zhì)”[10]。阻斷NF-κB活性，可降低動物內(nèi)毒素血癥模型的死亡率。未活化的NF-κB以具有IκB的聚合物形式或以與前體蛋白的2種聚合物形式存在。在炎癥誘導因子的刺激中，NF-κBp65從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核中以調(diào)節(jié)炎性細胞因子的表達[11]。NRPRP炎癥小體激活和IL-1β分泌最近成為肺損傷等疾病發(fā)病的重要機制。與銜接蛋白ASC復合的NLRP3誘導Caspase-1的激活，以響應(yīng)各種刺激[12]。活化的 Caspase-1切割pro-IL-1β 并促進 IL-1β 的分泌。NLRP3／ASC／Caspase-1軸在LPS誘導的肺損傷中起重要作用，抑制NLRP3炎性體激活具有抵抗脂多糖誘導急性肺損傷的能力[13]。本研究中，為了闡明川芎嗪的保護機制，檢測了川芎嗪對NF-κB和NLRP3炎癥小體的影響。結(jié)果顯示，與模型組比較，川芎嗪組大鼠肺NF-κB mRNA及NLRP3 mRNA、蛋白表達水平均明顯降低，表明川芎嗪通過抑制NF-κB和NLRP3炎性表達的活化來抑制炎性反應(yīng)。模型組、川芎嗪組大鼠肺IL-2，IL-6，TNF-α表達水平均明顯升高；與模型組大鼠比較，川芎嗪組大鼠IL-2，IL-6，TNF-α表達水平均明顯降低。說明川芎嗪能抑制炎癥信號通路NF-κB mRNA及NLRP3 mRNA、蛋白表達水平，從而抑制炎性因子IL-2，IL-6，TNF-α的表達。

綜上所述，川芎嗪對嚴重燒傷大鼠ALI有防護作用，其機制與川芎嗪能抑制炎癥信號通路NF-κB mRNA及NLRP3 mRNA、蛋白表達水平，從而抑制炎性因子IL-2，IL-6，TNF-α 的表達有關(guān)。