多成分含量測(cè)定結(jié)合高效液相色譜指紋圖譜評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地大青葉藥材質(zhì)量

李 媛，張苗苗，張 鑫，張 楠，謝志民

（陜西省西安市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710054）

大青葉為十字花科植物菘藍(lán) Isatis indigotica Fort.的干燥葉，產(chǎn)于河北、江蘇、浙江、安徽、河南、湖北、甘肅等地，性味苦寒，歸心經(jīng)、胃經(jīng)，具有清熱解毒、涼血消斑的功效[1]，以及抗病毒[2]、抗內(nèi)毒素[3]和抑菌[4]等活性，臨床用于各種病毒性流行性感冒、乙型腦炎、單純皰疹病毒性角膜炎、流行性腮腺炎和病毒性肝炎等傳染性疾病的治療[5]。大青葉化學(xué)成分以生物堿類為主，包括靛藍(lán)、靛玉紅等吲哚類和4（3H）喹唑酮、4-羥基喹唑啉、2，4-羥基喹唑啉、色胺酮等喹唑酮類生物堿，此外還含有丁香酸、水楊酸等有機(jī)酸類[6]。采用單一指標(biāo)性成分的含量進(jìn)行中藥材質(zhì)量控制存在一定缺陷[7-10]。指紋圖譜能全面表征藥材內(nèi)在的化學(xué)成分種類和數(shù)量，可綜合反映和有效控制藥材整體質(zhì)量[11-12]。借助色譜技術(shù)，可得到其化學(xué)成分的色譜圖，具有特征強(qiáng)、信息量大和整體性強(qiáng)的特點(diǎn)，已成為國(guó)際公認(rèn)的控制中藥或天然藥材質(zhì)量的有效手段[13-14]。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定大青葉中4-羥基喹唑啉、2，4-羥基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅6種有效成分，并建立大青葉的指紋圖譜，能有效評(píng)價(jià)和控制藥材質(zhì)量，可為完善大青葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；BT25S型，BT124S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；磷酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；娃哈哈純凈水；4-羥基喹唑啉（批號(hào)為 A83DC-NR，含量 ＞98.0%）和2，4-羥基喹唑啉（批號(hào)為 I8ZKG-TO，含量 ＞98.0%）均由梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司提供；丁香酸（Sigma-Aldrich，批號(hào)為 BCBS3754V，含量≥98.0% ），色胺酮（Toronto research chemicals INC，批號(hào)為T947000，含量為 98.0% ），靛藍(lán)（批號(hào)為 110716-200610），靛玉紅（批號(hào)為0717-200003），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；10批大青葉藥材分別購(gòu)自甘肅（S2，S10）、安徽（S1，S4，S6-S9，）、河北（S3）、江蘇（S5），經(jīng)西安市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室謝志民主任藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Shim-pack GIST C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃ ；檢測(cè)波長(zhǎng)：(0～29 min)225 nm，(29～85 min)254 nm；分析時(shí)間：85 min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：甲醇（A） -0.1% 磷酸溶液（B），梯度洗脫條件見(jiàn)表 1；流速：1.0 mL ／min。在此色譜條件下的色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

取 4-羥基喹唑啉 10.32 mg，2，4-羥基喹唑啉5.20 mg，丁香酸 8.60 mg，精密稱定，置同一 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液Ⅰ；分別取色胺酮 5.02 mg，靛藍(lán) 5.31 mg，靛玉紅 15.0 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，然后精密量取上述對(duì)照品貯備液Ⅰ1 mL，加氯仿10 mL超聲溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液Ⅱ。其中，4-羥基喹唑啉、2，4-羥基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅質(zhì)量濃度分別為 41.28，20.80，34.40，200.80，212.40，600 μg ／mL。取大青葉粉末約 3 g，精密稱定，置平底燒瓶中，加入50 mL氯仿，搖勻，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加氯仿補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，濾液濃縮至盡干，用甲醇-氯仿（8∶2）轉(zhuǎn)移定容至10 mL容量瓶，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品貯備液Ⅱ0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL，置 25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度。按擬訂色譜條件進(jìn)樣，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分回歸方程與線性范圍(n＝5)

精密度試驗(yàn)：按擬訂色譜條件，精密量取對(duì)照品溶液 10 μL，連續(xù)進(jìn)樣 6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果 4-羥基喹唑啉、2，4-羥基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅峰面積的 RSD分別為 0.64%，0.67%，0.65%，0.58%，0.66%，0.32%(n ＝ 6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品S3粉末3 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件下分別于 0，2，4，8，12，24 h時(shí)測(cè)定峰面積。結(jié)果4-羥基喹唑啉、2，4-羥基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅峰面積的 RSD分別為1.52% ，1.64% ，1.72% ，0.92% ，0.87% ，0.53%(n＝6)，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品S3粉末，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定。結(jié)果4-羥基喹唑啉、2，4-羥基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅含量的 RSD 分別為 1.81% ，1.62% ，1.43% ，0.76% ，0.65%，0.48%(n ＝ 6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品S3粉末1.5 g，精密稱定，共6份，每份加入相同量（為已知含量的100%）的4-羥基喹唑啉、2，4-羥基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛藍(lán)和靛玉紅對(duì)照品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.1.4 樣品含量測(cè)定

分別取10批大青葉粉末各3 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2 聚類分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對(duì)10批大青葉藥材中6種成分含量進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間聯(lián)接法，平方歐式距離為區(qū)間，得到10批藥材的聚類分析圖，詳見(jiàn)圖2。不同產(chǎn)地大青葉藥材含量差異較大，同一類含量差異較小。

表4 樣品各成分含量測(cè)定結(jié)果（ g／g）

圖2 10批大青葉藥材系統(tǒng)聚類分析

2.3 指紋圖譜建立

2.3.1 色譜條件

同 2.1.1項(xiàng)下色譜條件。

2.3.2 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取同一批樣品S3粉末，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以4號(hào)峰（色胺酮）的保留時(shí)間和峰面積為參照。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的 RSD分別在0.35%和0.94%以內(nèi)(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣S3粉末3 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于 0，2，4，8，12，24 h時(shí)測(cè)定峰面積。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的 RSD分別在 0.46%和 1.73%以內(nèi)(n＝6)，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品S3粉末，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的 RSD分別在0.62%和2.91%以內(nèi)(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 不同產(chǎn)地大青葉指紋圖譜建立

分別精密稱取10批大青葉樣品粉末，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，得10批樣品圖譜。采用中國(guó)藥典委員會(huì)推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版軟件分析，以中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.5 min，根據(jù)匹配結(jié)果確定了大青葉共有峰為15個(gè)。由于4號(hào)峰（色胺酮）較穩(wěn)定，且與鄰近峰基本可達(dá)到基線分離，因此選擇此峰作為參照峰。10批大青葉的指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均在0.90以上。結(jié)果見(jiàn)圖3及表5。

圖3 10批大青葉的指紋圖譜

表5 10批樣品相似度結(jié)果

3 討論

考察了超聲提取、加熱回流提取2種方法對(duì)各成分的影響，結(jié)果采用加熱回流得到色譜峰個(gè)數(shù)和峰面積均較多，故選擇此方法提??；又采用了甲醇、甲醇-氯仿不同比例、二氯甲烷、氯仿等不同溶劑進(jìn)行加熱回流提取，結(jié)果采用氯仿提取得到的各成分含量均較高，故確定為氯仿加熱回流提取。

考察了甲醇 -水、乙腈-水、甲醇 -0.1%磷酸溶液，最終確定甲醇-0.1%磷酸溶液及文中梯度洗脫方法，色譜圖中各成分分離效果最佳。4-羥基喹唑啉最大吸收波長(zhǎng)為225 nm，靛藍(lán)和靛玉紅2015年版《中國(guó)藥典(一部)》方法波長(zhǎng)為 606 nm和 289 nm[15]，為兼顧各成分的響應(yīng)值，故采用變換波長(zhǎng)的方法。

10批大青葉靛玉紅的含量均高于0.020%，質(zhì)量符合2015年版《中國(guó)藥典(一部)》規(guī)定。但其他成分的含量差異較大，尤其是4-羥基喹唑啉和2，4-羥基喹唑啉。不同產(chǎn)地大青葉各成分含量差異較大，4個(gè)產(chǎn)地的吲哚類生物堿含量相當(dāng)，而甘肅和河北產(chǎn)地的喹唑酮類生物堿含量相對(duì)較高，表明其地域影響明顯。同一產(chǎn)地的大青葉各成分含量也有差異，而已有文獻(xiàn)表明不同采收期會(huì)引起大青葉中靛玉紅含量差異明顯，頭刀葉含量大于二刀葉[16]，表明不同采收時(shí)間對(duì)大青葉中6種成分含量影響也較大，故使用和評(píng)價(jià)大青葉的質(zhì)量時(shí)應(yīng)考慮其產(chǎn)地和采收期的影響。

相似度考察結(jié)果表明，10批大青葉HPLC指紋圖譜相似度較高，均超過(guò)0.9，說(shuō)明藥材成分構(gòu)成基本一致，藥材質(zhì)量穩(wěn)定；聚類分析結(jié)果將10批大青葉藥材聚為4類，說(shuō)明不同產(chǎn)地的同種藥材之間存在一定差異。

HPLC法測(cè)定大青葉中6種成分的含量，以及建立指紋圖譜和聚類分析相結(jié)合的方法，不同于2015年版《中國(guó)藥典(一部)》方法的單成分指標(biāo)控制，能更全面、準(zhǔn)確地判別藥材的優(yōu)劣，可有效用于大青葉藥材的質(zhì)量控制與鑒定。