心脈通軟膠囊的質量控制及穩定性考察

鄭 林，劉麗娜，李月婷，李勇軍，黃 勇，王永林，蘭燕宇

（貴州醫科大學·貴州省藥物制劑重點實驗室／藥用植物功效與利用國家重點實驗室·民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004）

心脈通軟膠囊具有活血化瘀、通脈止痛的功效，臨 床用于冠心病心絞痛心血瘀阻所致胸痹心痛證，癥見胸悶、胸部刺痛，固定不移，心悸不寧，現已進入Ⅱ期臨床試驗。其由葒草、山楂葉、三七等多味中藥組方，主藥為葒草，有效成分異葒草素、葒草素具有抗氧化、抗凝血、抗菌等作用[1-3]，為葒草中主要活性成分。為有效控制該制劑的質量，本試驗中建立了方中葒草、山楂葉和三七鑒別的薄層色譜法和異葒草素、葒草素含量測定的高效液相色譜法，并考察了心脈通軟膠囊的穩定性。

1 儀器與試藥

儀器：LC-10Avp型高效液相色譜儀（日本島津公司）；WD-A型藥物穩定性檢查儀（天津藥典標準儀器廠）；AE2401型電子天平（十萬分之一，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；WP-UP-Ⅱ-20型超純水機（四川沃特爾科技發展有限公司）；CX-250型超聲波清洗器（功率為250 W，頻率為27～34 kHz，北京醫療設備二廠）。

試藥：葒草對照藥材經貴州醫科大學藥學院藥用植物學與生藥學教研室龍慶德副教授鑒定為正品，山楂葉對照藥材（批號為121340-200601）、三七對照藥材（批號為120941-200807）均購自中國食品藥品檢定研究院；異葒草素對照品、葒草素對照品（貴州醫科大學藥物研究開發中心用葒草藥材制備，純度大于98%）；心脈通軟膠囊(貴州醫科大學藥物研究開發中心提供，批號為 20120706，20120715，20120724）；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；硅膠G預制板（青島海洋化工廠）。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別[4-7]

葒草：取本品內容物 0.3 g，加乙醚 10 mL，超聲（功率為 220 W，頻率為50 kHz）處理5 min，濾過，棄濾液，濾渣揮干乙醚，加水15 mL溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，揮干，殘渣加甲醇1mL溶解，作為供試品溶液；另取葒草對照藥材1 g，加乙醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，揮干，殘渣加水15 mL，用乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，揮干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為對照藥材溶液；再按其處方工藝制備不含葒草的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典（四部）》通則 0502]試驗，吸取上述 3種溶液各 2 μL，分別條帶狀點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（10 ∶0.25 ∶0.25，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。結果見圖1 A。

山楂葉：取本品內容物 0.2 g，加乙醚 10 mL，超聲（功率為 220 W，頻率為 50 kHz）處理 5 min，濾過，棄濾液，濾渣揮干乙醚，沉淀加甲醇10 mL，漩渦混勻，濾過，濾液作為供試品溶液；取山楂葉對照藥材0.2 g，加乙醇30 mL，加熱回流 1.5 h，濾過，揮干，殘渣加水 15 mL，用石油醚（60～90℃）20 mL萃取，下層液用乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并上層液，揮干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為對照藥材溶液；再按其處方工藝制備不含山楂葉的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典（四部）》通則0502]試驗，吸取上述3種溶液各2 μL，分別條帶狀點于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇 -水（2∶1，V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。結果見圖1 B。

三七：取本品內容物 0.25 g，加乙醚 10 mL，超聲（功率為 220 W，頻率為 50 kHz）處理 5 min，濾過，棄濾液，濾渣揮干乙醚，加氨試液5 mL溶解，用正丁醇萃取2次，每次5 mL，合并上層溶液，加水5 mL，振搖提取，取上層液，揮干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液；取三七對照藥材 0.5 g，加水 5 mL，加正丁醇 5 mL，振搖提取，取上層液，加水15 mL，振搖提取，取上層液揮干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為對照藥材溶液；再按其處方工藝制備不含三七的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典（四部）》通則0502]試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別條帶狀點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇 -水（65∶30∶10，V／V／V）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于115℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。結果見圖1 C。

圖1 薄層色譜圖

圖2 高效液相色譜圖

2.2 異葒草素和葒草素含量測定[8-9]

2.2.1 色譜條件

色譜柱：DiamonsiL C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.1% 磷酸溶液（15 ∶85，V／V）；檢測波長：350 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL ／min。

2.2.2 溶液制備

稱取異葒草素、葒草素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋，制成質量濃度分別為 221.0，216.5 μg ／mL的混合對照品溶液。取裝量差異項下的本品內容物3 g，精密稱定，加乙醚10 mL，超聲（功率為220 W，頻率為50 kHz）處理5 min，棄乙醚液，沉淀加50%乙醇適量溶解后轉移至50 mL容量瓶中，加50%乙醇至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按處方比例制成缺葒草的陰性樣品，按2.3項下方法制得陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取對照品溶液、陰性對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖。結果，在對照品溶液和供試品溶液色譜圖相應位置上，異葒草素、葒草素分別有相同保留時間的色譜峰，且陰性對照無干擾。詳見圖2。

線性關系考察：精密量取對照品貯備液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，進樣測定，繪制工作曲線，計算得異葒草素、葒草素的線性回歸方程分別為 Y異＝23 472 860 X異-5 714（r＝0.999 9，n＝5），Y葒＝21 909 536 X葒＋2 195（r＝0.999 7，n＝5）。結果表明，異葒草素和葒草素的質量濃度分別在 11.05 ～88.40 μg／mL 和 10.83 ～86.60 μg／mL范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

精密度試驗：取同一供試品，依法制得供試品溶液，重復進樣5次，記錄色譜圖。結果異葒草素和葒草素峰面積的 RSD分別為 1.52%和 0.63%(n＝5)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，8 h時進樣測定，記錄色譜圖。結果異葒草素和葒草素峰面積的 RSD分別為 1.69%和 1.23%(n＝5)，表明供試品溶液在8 h內穩定。

重復性試驗：取同一供試品，依法制備5份供試品溶液，分別進樣，記錄色譜圖。結果異葒草素平均含量分別為 0.287 2% 和 0.178 8% ，RSD 分別為 1.53% 和1.83%(n＝5)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量的供試品（異葒草素和葒草素含量分別為0.287 2%和0.178 8%），分別精密加入異葒草素和葒草素對照品適量，依法制備供試品溶液，按色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算回收率。結果見表1。

2.3 穩定性考察[10-11]

各項檢驗項目的質量標準：見表2。

加速試驗：取模擬上市包裝樣品，置溫度（40±2）℃、相對濕度（75 ± 5）% 條件下貯藏，分別于 0，1，2，3，6 個月取樣，照心脈通軟膠囊質量標準檢測。結果3批樣品經加速試驗6個月考察，外觀性狀、裝量差異、崩解時限、微生物限度等各項檢測指標均符合規定；3批樣品中異葒草素和葒草素含量之和分別為 4.25，4.33，4.14， 4.15， 4.10 mg／粒 （ 批 號 為 20120706）； 3.56，3.71，3.65，3.56，3.51 mg／粒（批號為 20120715）；3.78，3.69，3.89，3.68，3.63 mg ／粒（批號為 20120724）。制劑中異葒草素和葒草素含量無明顯變化，且均能檢出葒草、山楂葉和三七，符合質量標準要求。

長期試驗：取模擬上市包裝樣品，置室溫條件下貯藏，在 0，3，6，12，18，24 個月取樣，照心脈通軟膠囊質量標準檢測。結果經24個月長期試驗考察，樣品外觀性狀、裝量差異、崩解時限、微生物限度等各項檢測指標均符合規定；3批樣品中異葒草素和葒草素含量之和分別為 4.25，4.10，4.19，4.31，4.14，4.13 mg／粒（批號為20120706），3.56，3.48，3.71，3.60，3.47，3.48 mg ／粒（批 號 為 20120715），3.78，3.91，3.95，3.82，3.72，3.77 mg ／粒（批號為 20120724）。制劑中異葒草素和葒草素含量無明顯變化，且均能檢出葒草、山楂葉和三七，符合質量標準要求。

表1 加樣回收試驗結果（n＝9）

表2 各項檢驗項目的標準

3 討論

采用薄層色譜法對心脈通軟膠囊中的葒草、山楂葉和三七藥材進行定性鑒別，在薄層色譜中分別檢出葒草、山楂葉和三七的特征斑點，斑點分離清晰，陰性對照無干擾，專屬性強，重復性好，可作為心脈通軟膠囊有效的定性鑒別方法。

采用高效液相色譜法測定制劑中異葒草素和葒草素時，由于本品為軟膠囊，含有大豆油，為避免污染色譜柱，樣品不能直接溶解進樣。異葒草素、葒草素為黃酮類化合物，能溶于乙醇等極性溶劑，而不溶于非極性有機溶劑，在供試品溶液制備方法研究過程中，分別采用了石油醚、乙醚、氯仿等溶劑去除樣品中油脂類物質，結果表明采用乙醚去除油脂操作簡便，效果較好。

在樣品穩定性考察試驗中，根據《原料藥物與制劑穩定性試驗指導原則》[2015年版《中國藥典（四部）》指導原則9001]，取3批市售制劑，進行加速試驗和長期試驗考察，除葒草、山楂葉和三七藥材的薄層鑒別，以及異葒草素和葒草素的含量測定外，還分別考察了外觀性狀、崩解時限、微生物限度，均符合質量標準要求。說明本品在24個月內質量穩定，直接接觸藥品的容器對藥品質量無影響，故心脈通軟膠囊的有效期暫定為24個月，為控制藥品質量及確定藥品貯存條件提供了科學依據。