CD137L在多發性骨髓瘤中的表達及生物學功能

夏莎莎，張 梓，夏瑞祥

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是漿細胞單克隆性增殖的惡性腫瘤，目前尚無根治方法。CD137配體(CD137 ligand，CD137L)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成員，在多種腫瘤細胞中發揮重要作用[1-3]。CD137 / CD137L在抗原提呈細胞表面，起雙向信號傳導作用，CD137L介導的逆向信號促進TNF分泌而抑制白介素10(interleukin- 10，IL- 10)分泌[4]。其中，IL- 10被認為能調節免疫細胞的分化及生長，抑制免疫細胞的活化[5]。應用抗CD137L抗體阻斷T細胞CD137-137L信號途徑，II類細胞因子IL- 10表達增高[6]。 研究[7]還顯示，IL- 10即可抑制機體的免疫功能從而促進腫瘤細胞免疫逃逸，也能直接促進腫瘤細胞增殖。該研究通過調節MM細胞內CD137L基因表達，探究其對IL- 10的分泌和MM細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI1640培養液購自美國Hyclone公司；胎牛血清、胰酶均購自美國Gibco公司；逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司；TB Green qPCR Master Mix試劑盒購自日本Takara公司； β- actin抗體購自美國BD公司；鼠抗人IgG單克隆抗體購自美國eBioscience公司；定制的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)購自德國凱基生物公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；鼠抗人CD137L單克隆抗體、人CD138微磁珠購自德國miltenyi生物公司。

1.2 標本采集收集2017年3月～2018年3月安徽醫科大學第一附屬醫院血液科收治的16例MM患者，所有患者的診斷均符合《中國多發性骨髓瘤診治指南(2017年修訂)》[8]。選擇14例血小板輕度減少、骨髓象正常的患者作為實驗對照組。按照人CD138磁珠(德國miltenyi公司)分選說明書的操作，分離出漿細胞。本研究已獲得本院醫學倫理委員會批準，所有實驗對象及家屬均已簽訂知情同意書。

1.3 細胞培養及siRNA轉染人MM 細胞株U266細胞采用細胞懸浮培養，按2.5×105個/孔鋪于6孔板中，配制轉染體系：分別將4種150 ng siRNA溶于200 μl含血清培養基中，再加入12 μl Hiperfect，均勻混合后加入6孔板。

1.4 Western blot方法檢測CD137L蛋白相對表達量采用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測蛋白濃度。30 μg樣品經SDS- PAGE凝膠電泳后轉至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，相應一抗(CD137L抗體：德國miltenyi生物公司；β- actin：美國BD公司)孵育過夜，TBST洗3次后，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗3次，ECL發光法曝光、顯影，用Image Pro plus分析軟件分析各條帶灰度值。

1.5 RNA提取、逆轉錄及RT- PCR法檢測CD137L mRNA相對表達量通過Trozel法提取細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒(美國Thermo Scientific 公司)操作方法將 mRNA 逆轉錄成 cDNA，按照qPCR試劑盒(日本Takara公司)說明配制反應體系。以β- actin為內參，計算出CD137L mRNA相對表達量。

1.6 共培養及ELISA法檢測IL- 10的分泌水平采用密度梯度離心分離骨髓單個核細胞，培養3 d后去懸浮細胞后即得骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，按2×104個/ml接種于6孔板，4 h棄上清液，備用。按下列方法設置4組。A組：MM細胞株U266單獨培養；B組：BMSCs單獨培養；C組：未轉染的MM細胞株U266與BMSCs共培養即(U266- siRNA- 0+BMSCs)；D組：轉染編號為2的siRNA處理后的MM細胞株U266與BMSCs共培養即(U266- siRNA- 2+BMSCs)，24 h后收集上清液并使用Human IL- 10 ELISA Kit測各組IL- 10的分泌水平。

1.7 CCK8法檢測細胞增殖情況細胞經處理后，加入10% CCK8溶液，繼續培養2 h后用酶標儀測出波長為450 nm的吸光度值(A450)，繪制細胞生長曲線。

2 結果

2.1 CD137L在MM患者的漿細胞中呈現高表達MM組患者骨髓血中漿細胞的CD137L蛋白表達(1.96±0.51)明顯高于對照組(1.00±0.29)，差異有統計學意義(t=6.460，P<0.001)。見圖1。

圖1 兩組患者骨髓血漿細胞CD137L蛋白表達水平

1、2： 非血液疾病患者；3、4：MM患者；與對照組比較：***P<0.001

2.2 CD137L基因沉默后mRNA表達明顯下降在轉染后不同時間，4條siRNA分別與對照組相比較，均可明顯下調U266細胞上CD137L mRNA表達水平，差異有統計學意義(B：t=10.281,P=0.005；C：t=21.439,P=0.001；D：t=4.509,P=0.022；E：t=16.615,P=0.002)。見圖2。

圖2 siRNA沉默CD137L基因后mRNA表達水平

A：siRNA對照組；D～E：CD137L特異性siRNA；與siRNA對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3 下調U266細胞的CD137L表達可促進IL- 10的分泌下調U266細胞內CD137L表達可促進共培養上清液中IL- 10的分泌，差異有統計學意義(t=14.732，P<0.01)。見表1。

表1 沉默CD137L基因對U266、BMSCs

與U266- siRNA- 0+BMSCs組比較：**P<0.01

2.4 沉默CD137L基因促進U266細胞增殖與對照組(siRNA- 0)相比較，沉默組(siRNA- 2)U266細胞在72 h后增殖明顯加快，差異有統計學意義(t=4.730，P=0.021)。見圖3。

圖3 siRNA沉默CD137L基因對U266細胞增殖的影響

siRNA- 0： 對照組；siRNA- 2：CD137L特異性siRNA；與對照組比較：*P<0.05

3 討論

MM是一種終末未分化的惡性腫瘤[9]。目前MM已成為發病率排名第2的血液系統腫瘤，雖然硼替佐米等蛋白酶體抑制劑、單克隆抗體、免疫調節及自體造血干細胞移植術廣泛用于MM的治療，顯著改善了MM患者的預后，但至今未有徹底治療的方法[10]。CD137/CD137L介導的逆向信號能促進單核細胞釋放巨噬細胞集落刺激因子從而影響細胞因子IL- 2、IL- 6、IL- 8、IL- 10等的分泌，其中IL- 10是作用機制十分復雜的腫瘤免疫抑制因子。IL- 10能作為自分泌或旁分泌生長因子促進腫瘤細胞生長，并能抑制細胞程序死亡，調節宿主微環境,影響腫瘤的轉移[11-13]。本實驗用4種siRNA轉染MM細胞株U266降低其表面CD137L的表達，U266在骨髓微環境下IL- 10分泌水平上升，U266細胞增殖加快，這提示CD137L在MM中可通過抑制IL- 10的分泌影響MM的增殖。Gullo et al[14]研究顯示CD137L分子在MM中呈現高表達，激活CD137L逆向信號可以促進炎性因子IL- 6和IL- 8的分泌，從而促進MM細胞的凋亡。同時，有研究[15]表明IL- 10參與了B細胞向漿細胞分化。本實驗以MM患者及非血液系統疾病患者的骨髓血為標本，驗證CD137L分子高表達于MM患者的漿細胞。在MM中CD137L是IL- 10分泌的抑制蛋白，CD137L的逆向信號在MM中的作用抑制IL- 10的分泌影響機體免疫調節，利用CD137L作為靶點研究對于疾病的治療可能具有十分重要的臨床意義。