HPLC同時測定關節炎大鼠血清色氨酸和犬尿氨酸

韓 萍，楊雪枝，趙英杰，張冰潔，李絲雨，張斌斌，常 艷，魏 偉

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種復雜的自身免疫病，特征是慢性滑膜炎癥和關節破壞，發病機制尚不清楚[1]。色氨酸(L- tryptophan, Trp)是人體必需氨基酸，可以調節適應性免疫[2-3]，多數Trp代謝是沿著犬尿氨酸(L- kynurenine, Kyn)途徑代謝的，該途徑產生Kyn及一系列代謝產物，參與炎癥免疫反應[4]。大鼠佐劑性關節炎(adjuvant arthritis, AA)模型在病理機制等方面與人的RA相似，是研究RA較為理想的模型之一[5]。本實驗通過建立AA模型，檢測正常和模型大鼠血清中Trp和Kyn含量變化，目前主要采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測Trp和Kyn的含量[6-7]，在制備標準曲線等時對使用的血清進行了透析，此法可在同時測定Trp和Kyn的條件下，減少干擾因素。

1 材料與方法

1.1 樣本動物為健康雄性SD大鼠20只，合格證號：[SCXK(皖)2017-001]，體質量(170±20)g，購自安徽醫科大學實驗動物中心。樣本的收集AA大鼠成模后處死取血于15 ml離心管中，靜置2 h后，2 000 r/min離心20 min，取上清液，并于-20 ℃保存。

1.2 儀器Agilent1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Sigma 3- 30K高速冷凍離心機(上海納騰儀器有限公司)；AA- 200DS電子分析天平(美國Denver儀器公司)；Amicon Uitra- 0.5超濾離心機(美國Millipore公司)。

1.3 試劑L- Trp(WXBC4097V)、L- Kyn(BCBT1074)購自德國SIGMA- ALORICH，純度≥98%；冰醋酸(20170106)、醋酸鈉(20170320)、高氯酸(20170204)均為分析純，購自中國醫藥集團化學試劑有限公司。

1.4 AA大鼠模型的制備將大鼠隨機分為兩組，即對照組和模型組，每組10只。將 BCG 80 ℃水浴滅活1 h，與經過高壓滅菌的石蠟充分研磨，制成10 mg/ml完全弗氏佐劑(complete freund adjuvant,CFA)，于大鼠右后足跖皮內注射CFA 0.1 ml致炎[8]，正常組用生理鹽水同法注射。

1.5 溶液的配制

1.5.1儲備液配制 精密稱取L- Trp對照品40.90 mg，L- Kyn對照品2.08 mg，用體積百分比為2.5%的高氯酸溶解，定容至10 ml容量瓶中，得濃度20 000 μmol/L、1 000 μmol/L對照品儲備液，4 ℃保存，用時稀釋。

1.5.2流動相溶液配制 精密稱取醋酸鈉4.922 8 g, 加純水溶解于100 ml容量瓶中定容，制成600 mmol/L儲備液。用時加純水稀釋得15 mmol/L溶液，冰醋酸調節pH至4，再用0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.5.3血清透析 將透析袋在體積2% (w/v) NaHCO3和1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中將透析袋煮沸10 min，再放在1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中煮沸10 min，冷卻后放于4 ℃。將需要透析的血清裝入透析袋，放入KrebsRinger磷酸鹽緩沖液[78.1% NaCl溶液，2.3% CaCl2-2H2O溶液，3.1% KCl溶液，0.8% MgSO4-7H2O，15.6%Na2HPO4-HCl緩沖液(pH 7.4)]中，血清：緩沖液(1 ∶25，v/v)，于4 ℃透析36 h，緩沖液每8～10 h更換1次，至少更換3次。

1.5.4供試品溶液的配制 取透析血清100 μl于離心管中，加入100 μl 5%高氯酸，充分混勻，14 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，取20 μl進樣。

1.6 色譜條件色譜柱：Agilent TC- C18(250 mm×5 mm, 5 μm)；流動相 ∶乙腈 ∶醋酸鈉(體積百分比8 ∶92)；流速1.0 ml/min；Trp紫外檢測波長：280 nm；Kyn紫外檢測波長:360 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。

2 結果

2.1 AA大鼠模型的建立模型組大鼠在免疫后第14天出現繼發病變，出現足爪紅腫，體質量減輕，全身評分、關節炎指數、關節腫脹數和足爪腫脹度明顯增加，與正常組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1～6。

圖1 肉眼觀察大鼠足爪腫脹

2.2 HPLC方法學結果

2.2.1專屬性實驗 在1.6項色譜條件下分別對空白血清、空白血清加對照品溶液、供試品溶液進樣分析，Trp保留時間9.0 min，Kyn保留時間5.6 min，峰形良好，樣品中其他內源性物質不干擾測定，與雜質分離良好。結果見圖7～9。

圖2 大鼠全身評分

圖3 大鼠關節炎指數

圖4 大鼠關節腫脹數

圖5 大鼠足爪腫脹度

2.2.2線性關系考察

2.2.2.1Trp標準曲線 取20 000 μmol/L Trp對照品儲備液，加入空白血清中，使Trp濃度分別為25、50、100、250、500、1 000 μmol/L，并按1.5.4中供試品溶液處理后進行HPLC分析。以加入對照品溶液樣品峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸，得標準曲線方程，Trp:Y=2.387 8X-6.893 5,R2=0.999 8, Trp在25～1 000 μmol/L范圍內線性關系良好。見表1。

2.2.2.2Kyn標準曲線 取1 000 μmol/L Kyn對照品儲備液，加入空白血清中，使Kyn濃度分別為0.5、1、2、5、10、20 μmol/L，并按1.5.4中供試品溶液處理后進行HPLC分析。得標準曲線方程，Kyn:Y=2.753 8X-1.156 6,R2=0.999 3, Kyn在0.5～20 μmol/L范圍內線性關系良好。見表2。

圖6 大鼠體質量變化

表1 Trp標準曲線

圖7 空白血清Kyn和Trp色譜圖

編號123456濃度(μmol/L)0.51251020峰面積0.96±0.271.68±0.424.94±0.1512.80±0.7025.88±1.7154.20±2.33

圖8 空白血清外加對照品色譜圖

2.2.3檢測限和定量限 在血清中加入一定量的對照品溶液，按1.5.4項中樣品處理方法進行HPLC分析并做3次平行實驗。按信噪比(S/N)為3計檢測限，Trp、Kyn檢測限分別為0.27 μmol/L、0.07 μmol/L；按S/N為10計定量限，Trp、Kyn定量限分別為0.83 μmol/L、0.56 μmol/L。

2.2.4回收率(準確度)試驗 取Trp和Kyn對照品溶液加入到空白血清中制成低、中、高3個濃度的標準血樣，處理后進行HPLC分析，每個濃度1 d內平行配制3個樣品，測定回收率，Trp回收率為96.71%～112.58%，Kyn回收率為92.60%～117.82%。見表3。

表3 Trp和 Kyn回收率

圖9 實際樣品Trp和Kyn色譜圖

活性物質濃度(μmol/L)日內精密度實際樣品濃度(μmol/L)RSD(%)日間精密度實際樣品濃度(μmol/L)RSD(%)Trp5054.13±2.684.9553.65±2.414.49250242.39±3.451.43244.57±4.021.65500812.96±29.763.67816.58±26.733.27Kyn11.090±0.0978.901.100±0.0837.5555.756±0.1462.545.690±0.1332.341012.009±0.2812.3411.893±0.3723.13

2.2.5精密度試驗 取Trp和Kyn對照品溶液加入空白血清中制成低、中、高3個濃度標準血樣，每個濃度水平1 d內平行配制3個樣品，測定日內精密度，每個濃度水平3 d內測定3次，計算日間精密度。Trp和Kyn相對標準偏差(RSD)均小于15%，符合樣品分析要求。見表4。

2.2.6穩定性試驗 取Trp和Kyn對照品溶液加入血清中，供試品分別在4 ℃、25 ℃下放置。將供試品分別在0、4、8、12、16、20、24 h測定Trp和Kyn含量考察其穩定性，結果表明樣品在4 ℃和25 ℃均可穩定放置24 h，穩定性較好，符合生物樣品穩定性測定的要求。

2.3 實際樣品中Trp和Kyn測定用上述建立的方法測定了正常組和模型組大鼠血清中Trp和Kyn濃度。經分析，模型組和正常組的差異有統計學意義(P<0.01)，與正常組比較，Trp的濃度降低，Kyn的濃度升高，Kyn/Trp比值升高。見表5。

表5 實際樣品測定結果

與正常組比較：**P<0.01

3 討論

由于Kyn代謝與炎癥免疫之間有著密切的關系，Kyn已成為RA等多種疾病的參與者[9]。在正常機體中，Trp和Kyn維持著一個動態平衡，但當體內的Trp和Kyn含量變化時，機體會誘發各種疾病，例如自身免疫病或惡性腫瘤等[4,10]。吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine2,3- dioxygenase,IDO1) 是此代謝通路的限速酶之一，目前大多數的研究是采用測定Kyn和Trp比值來評價IDO1的活性[11]，定量測定體內Trp和Kyn濃度為診斷相關疾病提供了重要的依據。

大鼠體內的Trp和Kyn均為內源性物質，建立方法學時需采用不含待測物的空白血清，排除血清自身Trp和Kyn對定量測定的干擾，本實驗采用Krebs- Ringer磷酸鹽緩沖液進行血清透析，可獲得不含或含極少量內源性物質的空白血清樣本。為了更進一步提高測定的準確性，還采用了標準加入法對Trp和Kyn進行檢測[12]。用HPLC測定血清中Trp、Kyn時需去除血清中的蛋白，本實驗采用高氯酸蛋白沉淀法，無需衍生化處理與梯度洗脫，并與之前文獻[13]報道相比保留時間縮短，節約時間。本實驗流動相中乙腈的比例調到8%，相對于乙腈比例為3%或4%峰面積響應值增大，保留時間縮短。流速太小，峰面積響應值小，出峰時間較長，但流速太大，柱壓較大，最終采用1.0 ml/min的流速。

隨著對Trp、Kyn及其他代謝產物的的深入研究發現，Kyn是此代謝通路上極為重要的中間代謝物，在多種疾病中有重要作用，與疾病發展密切相關[14]，檢測Trp和Kyn濃度變得極為重要。結果表明，與對照組比較，AA大鼠Trp和Kyn及其比值都有顯著變化，Trp濃度降低，Kyn濃度升高，Kyn/Trp升高，提示Trp- IDO1- Kyn代謝通路異常可能參與RA的發生發展。HPLC有準確、靈敏度高等特點，是現階段檢測Trp和Kyn含量的主要方法。經過本實驗實際應用，只需將血清去除蛋白，無需柱前衍生化即可進行測定，且專屬性、線性范圍、檢測限、定量限、準確度、精密度、穩定性等方法學指標均符合測定要求，適用于大鼠體內Trp和Kyn含量測定。