原發性皮膚淀粉樣變一家系全基因組測序結果及初步分析

張玉玲，呂 萍，吳芳芳，楊 超，陳軍臣，薛汝增，郭君怡，陳俊溢，楊 斌

原發性皮膚淀粉樣變(primary cutaneous amyloidosis, PCA)指淀粉樣蛋白沉積于皮膚組織中而不累及其他器官的一種慢性皮膚病，少數患者有家族史，多數患者有瘙癢的癥狀，苔蘚樣淀粉樣變最常見。家族性原發性皮膚淀粉樣變(familial primary cutaneous amyloidosis, FPCA)多為青春期前后發病，其發病機制尚不清楚，可能與長期刺激(如摩擦)、紫外線輻射、愛潑斯坦-巴爾二氏(Epstein-barr, EB)病毒感染、遺傳等因素相關[1]。2006年，Lee et al[2]通過全基因掃描技術，發現FPCA與染色體5p13.1- g11.2存在連鎖；2008年，Arita et al[3]首次發現FPCA致病基因為定位于染色體5p13.1- g11.2上的抑瘤素M受體(oncostatin M receptor, OSMR)基因。2010年，Lin et al[4]對臺灣29個FPCA進行篩查，發現10個家系存在OSMR基因雜合錯義突變，一個家系存在白介素- 31受體(interleukin- 31 receptor A，IL- 31RA)基因點突變，18個家系中無OSMR和IL31RA基因突變。無OSMR或者IL- 31RA基因突變的家系患者，其發病可能與其他遺傳因素相關。因此，通過對一家系進行全基因組測序進一步尋找FPCA患者可能候選致病性基因。

1 材料與方法

1.1 病例資料先證者女，見圖1中Ⅱ- 4，29歲，19歲時無明顯誘因下雙脛前出現對稱性的褐色針尖大小的丘疹，伴明顯瘙癢，后皮疹逐漸增至米粒大小，丘疹密集分布但不融合，見圖2，曾予多種藥物外用治療，皮疹未退，且易反復。其他系統檢查未見明顯異常。家族中先證者的父親(Ⅰ- 2)、哥哥(Ⅱ- 1)、弟弟(Ⅱ- 5)發病年齡分別為47、20、24歲，皮疹形態與先證者類似，Ⅱ- 1瘙癢癥狀重，Ⅱ- 5瘙癢癥狀輕，Ⅰ- 2無瘙癢。家族中其他成員否認類似疾病史。先證者左小腿丘疹組織病理：可見真皮乳頭增寬，其內可見均一嗜酸性團塊狀物，剛果紅染色陽性，見圖3。家族中的患者均在廣東省皮膚病醫院皮膚科確診為苔蘚樣皮膚淀粉樣變病。

圖1 PCA家系圖

Ⅱ- 4為先證者；*：采血并做基因檢測，其中Ⅲ- 3為Sanger測序，余均為二代測序

圖2 先證者的臨床表現

A: 先證者雙脛前褐色米粒大小的丘疹，丘疹密集分布但不融合；B：先證者皮損區的局部放大圖

圖3 先證者左小腿脛前皮損組織病理

A：箭頭處可見呈嗜伊紅性無結構的玻璃樣物質，沉積物與表皮間有裂隙 HE×200；B：剛果紅染色可見真皮乳頭均質紅染的團塊狀沉積物 ×200

1.2 方法

1.2.1基因組DNA提取 收集該家系中3例患者(Ⅰ- 2、Ⅱ- 1、Ⅱ- 4)和3例健康成員(Ⅰ- 1、Ⅱ- 2、Ⅲ- 3)的外周血5 ml，通過血液基因組DNA試劑盒(天根生化科技北京有限公司，貨號DP314)提取基因組DNA。本研究通過廣東省皮膚病醫院醫學倫理委員會批準(GDDHLS- 20171029)，該家系成員在采取血樣前均簽署知情同意書。

1.2.2篩選可疑突變基因及位點 采用Hiseq 4000測序儀(美國Illumina公司)對人樣本進行全基因組測序，先對原始數據首先應進行數據質控，將得到單核苷酸變異(single nucleotide variation, SNP)和插入缺失(insertion variation, InDel)位點與人類參考基因組比對，采用顯性遺傳模式對該家系進行過濾，篩選外顯子區和剪接區變異(保留非同義突變和剪接區變異)，過濾掉高頻突變位點，得到該家系的基因突變位點。另外，對已知突變的OSMR基因的外顯子進行Sanger測序。

1.2.3對滿足家系共分離及非同義突變的基因分析 利用在線人類孟德爾遺傳(online mendelian inheritance in man，OMIM)數據庫、基因本體(gene ontology, GO)數據庫和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數據庫分析其生物學特征及編碼蛋白可能的作用機制，之后利用SIFT、Polyphen- 2軟件篩選出能導致編碼蛋白功能異常的候選基因(候選位點)，最后在美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)逐個對以上候選基因進行查閱。

2 結果

2.1 可疑突變基因及位點該家系中3例患者(Ⅰ- 2、Ⅱ- 1、Ⅱ- 4)和2例健康成員(Ⅰ- 1、Ⅱ- 2)經二代測序，得到SNP和InDel位點數目分別為3 870 204個、819 403個，滿足家系共分離(顯性遺傳模式)的SNP和InDel位點數目分別為85 781個、11 078個。3例患者共有的SNP、InDel位點數目分別為21個、3個，共有的結構變異(structure variation, SV)、拷貝數變異(copy number variation, CNV)位點數目分別為365個、152個。IL- 31RA基因中滿足家系共分離的SNP和InDel位點數目分別是5個和1個，OSMR基因中分別是4個和0個。

二代測序發現，Ⅰ- 2、Ⅱ- 1、Ⅱ- 4患者的OSMR基因11號外顯子中第1 538位鳥嘌呤被腺嘌呤替代(c.1538G>A)，導致第513號氨基酸序列由甘氨酸轉變為天冬氨酸 (p.Gly513Asp)；另外，Sanger測序檢測OSMR基因，在患者(Ⅰ- 2、Ⅱ- 1、Ⅱ- 4)及成員Ⅲ- 3中也發現了OSMR基因p.Gly513Asp位點突變；同時在正常人(Ⅰ- 1、Ⅱ- 2)和PCA患者(Ⅱ- 1、Ⅱ- 4)中還發現OSMR 基因第15號外顯子第2 090位腺嘌呤被胞嘧啶替代(c.2090A>C)，該位點突變可導致第697號氨基酸序列由賴氨酸轉變為蘇氨酸(p.Lys697Thr)。通過OSMR基因Sanger測序與二代測序結果比對，在健康成員(Ⅰ- 1、Ⅱ- 2)和PCA患者(Ⅱ- 1、Ⅱ- 4)的二代測序的原始數據中也發現了OSMR基因p.Lys697Thr位點突變。見圖4。

2.2 滿足家系共分離及非同義突變的基因分析通過GO分析發現，這些基因主要富集在細胞膜、細胞質中間絲、細胞骨架等細胞組件，參與信號傳感器活動、分子轉導活性、蛋白偶聯受體活性、信號受體活性、受體活性等分子功能，涉及細胞黏附、生物黏附、細胞-細胞黏附、化學刺激的感官知覺、感官知覺等生物過程。KEGG 通路分析發現，這些基因可能與黏附斑激酶通路、Janus蛋白酪氨酸激酶(Janus activated kinase, Jak)-信號傳導及轉錄激活因子(signal transduction and activators of transcription, STAT)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen- activated protein kinase， MAPK) 信號通路、內質網蛋白質加工通路、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路、鈣信號通路、細胞凋亡通路等相關。使用SIFT、Polyphen- 2軟件對以上基因進行有害性預測，最終篩選出26個候選基因：ANKRD30A、CHRNB2、CNTNAP5、CPA5、EPHB6、FLG2、GIMAP1- GIMAP5、GIMAP5、HNRNPU、KIAA0040、KIAA1549、KIRREL3、LOC155060、LRP6、MPZL2、OR1S2、PCDHA10、PCDHB8、PRH1、PRH1- TAS2R14、RIMKLB、RPS6KC1、SCARB2、SLC38A4、SYNE1、TNFSF18。對于OSMR基因，滿足家系共分離與非同義突變位點的SNP為1個，即p.Gly513Asp，但該位點在千人數據庫中的頻率為0.01，不滿足突變頻率小于0.005的這個條件，沒有被篩選出來；而另一個p.Lys697Thr位點也存在于健康對照者，不滿足家系共分離的條件，因此也沒有被篩選出來。對于IL- 31RA基因滿足家系共分離的SNP和InDel分別是5個和1個，但這些位點不滿足非同義突變這一條件，因此沒有被篩選出來。對以上26個基因逐個進行文獻檢索發現，低密度脂蛋白受體相關蛋白6(the low density lipoprotein receptor- related protein, LRP6)基因在阿爾茨海默病的淀粉樣前體蛋白的代謝過程、β淀粉樣蛋白的產生中起重要作用；絲聚蛋白2(filaggrin 2, FLG2)基因與皮膚的角化和皮膚屏障相關。LRP6、FLG2可能與FPCA發病相關。

圖4 FPCA患者基因測序結果

A：先證者OSMR基因的11號外顯子的部分測序圖；B、D：為健康對照者OSMR基因的11號、15號外顯子的部分測序圖；C：先證者OSMR 基因的15號外顯子的部分測序圖；箭頭表示突變位點

3 討論

FPCA是一種主要表現為常染色體顯性遺傳的皮膚病，也可見常染色體隱性遺傳，發病機制尚不清楚，但其家族聚集性和種族易感性表明遺傳因素在該疾病的發生過程中可能有重要作用。目前大多數學者認為與FPCA發病最相關的基因是OSMR基因的突變，有報道[3-5]該基因突變可能會影響JAk- STAT、MAPK信號通路的激活，影響角質形成細胞的增殖、分化、凋亡。OSMR基因突變位點主要集中于OSMRβ蛋白胞外區纖連蛋白- Ⅲ型亞區中，該突變可能會導致該亞區的受體域發生變化，影響受體域的空間構型、定位和受體二聚化的形成[5]。本家系中OSMR基因p.Gly513Asp位點突變與郭獨一等[1]對兩家系OSMR基因全外顯子及其側翼序列進行測序的結果一致，說明OSMR基因的p.Gly513Asp位點突變可能是PCA的致病性基因突變位點。然而，Sanger測序發現在本家系健康成員Ⅲ- 3也出現了OSMR基因p.Gly513Asp位點突變，隨訪Ⅲ- 3發現有瘙癢的表現，但是未表現出FPCA的體征，推測可能其暫未到發病年齡(Ⅲ- 3現年齡為7歲,其父親發病年齡為24歲)。除此之外，本家系中的OSMR基因p.Lys697Thr位點攜帶者Ⅰ1(女，33歲)、Ⅱ2(女，56歲)并未發病，可能是因為環境或其他因素的影響，導致突變位點在本家系部分成員中外顯缺失，未出現疾病表型。

通過對本家系成員全基因組測序，篩選出3例患者共有的SV、CNV 、SNP、InDel位點數目分別為365、152、21、3個。對編碼區SNP和InDel進行多步過濾后再行GO、KEGG分析，發現這些基因參與信號傳感器活動、分子轉導活性、蛋白偶聯受體活性、信號受體活性等分子功能，涉及細胞-細胞黏附、化學刺激的感官知覺等生物過程；可能與黏附斑激酶通路、Jak- STAT信號通路、MAPK 信號通路、mTOR信號、鈣信號通路、細胞凋亡通路等相關。利用SIFT、PolyPhen- 2軟件對以上這些基因進行有害性預測，最終篩選出26個候選基因，通過文獻檢索發現, LRP6基因、FLG2基因可能參與PCA的發病。

LRP是體內一類多配基受體，在經典Wnt信號傳導中具有關鍵功能，而Wnt信號通路在淀粉樣前體蛋白的加工中可能具有重要作用。Liu et al[6]研究者在阿爾茨海默病患者的腦組織中發現LRP6水平降低，LRP6缺陷會影響阿爾茨海默病患者的神經突觸，并有助于β淀粉樣蛋白產生和形成[7]。此外，LRP6與前體蛋白相互作用，激活非經典Wnt信號傳導，增加β 淀粉樣蛋白的產生[8]。載脂蛋白E為LRP配體之一，參與阿爾茨海默病淀粉樣物質的形成過程[9]。載脂蛋白E 是PCA淀粉樣沉積物的主要成分之一[10]。因此，推測LRP6基因也可能與PCA的淀粉樣物質的形成相關，但需要進一步的驗證。

FLG2基因編碼絲聚蛋白2，該蛋白為S100融合蛋白質，在蛋白質結構、氨基酸組成、表達模式和生物化學性質方面與絲聚蛋白非常相似。FLG2蛋白和絲聚蛋白可能在表皮屏障的形成中具有重疊和協同作用，它們可以提供天然保濕因子的前體，從而保護皮膚免受環境侵害和水分逸出[11-12]。FLG2蛋白不僅可以維持上皮細胞穩態，還有助于皮膚適當的角化，因此許多皮膚屏障受損與該基因缺陷有關[13]。因此，推測FLG2基因功能異常可能促進了PCA癥狀的發生或加重。

綜上所述，通過全基因組測序和生物信息學分析，在一個PCA家系中證實了既往已報道的OSMR基因突變，并且還發現LRP6、FLG2基因也可能與PCA的發生相關，但仍需要大量樣本驗證，相關功能需進一步研究。