Bach2在嗜酸粒細胞性慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉組織中表達及臨床意義

吳 君，汪銀鳳，潘春晨

慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)是耳鼻喉科常見的涉及鼻竇和鼻黏膜的慢性炎癥性疾病，具有異質性和復雜發病機制，目前分為兩種類型：慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉 (chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP) 和慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)[1]。CRSwNP主要是以組織Th2炎癥及嗜酸粒細胞浸潤為主，而區別于CRSsNP以 Th1炎癥為主[2]。CRSwNP依據是否伴有嗜酸粒細胞浸潤，可以進一步分為兩種亞型：嗜酸粒細胞性慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(eosinophilic CRSwNP，ECRS) 和非嗜酸粒細胞性慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(non- eosinophilic CRSwNP，non- ECRS)[3]。ECRS相較non- ECRS而言，有更高的臨床疾病嚴重程度體驗和術后更易復發的風險[4]。BTB與CNC同源基因2(BTB and CNC homology2，Bach2)定位在人的6號染色體的長臂(6q15)，其轉錄的蛋白能夠與小Maf蛋白(包括MafF、MafG和MafK)結合形成異源二聚體，并在DNA上結合特異性序列上Maf識別元件，從而抑制細胞轉錄并參與其轉錄調節過程[5]。Bach2參與T細胞介導的免疫反應，Treg介導的免疫穩態，并調節Th2細胞分化和Th2型免疫反應，而Bach2缺陷型小鼠易患致命性肺部和小腸感染[6-7]。而對于Bach2是否在慢性鼻-鼻竇炎中表達仍未有研究報道，該研究首次探究Bach2在不同表型的鼻息肉組織中的分布情況及與疾病嚴重程度的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料43例CRSwNP患者分為嗜酸性慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉組(ECRS組)19例、非嗜酸性慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉組(non- ECRS組)24例，受試者對照組(Control組)20例。所有研究對象均來自安徽省立醫院耳鼻咽喉頭頸外科。慢性鼻-鼻竇炎的診斷均符合國內2012年的慢性鼻-鼻竇炎診療指南[1]。排除標準：① 患者在手術前1個月內使用局部或全身性類固醇激素；② 既往有鼻竇手術史，術前患有真菌性鼻竇炎、后鼻孔息肉、原發性纖毛運動障礙、變應性鼻炎、哮喘、肺結核等感染性疾病和過敏性疾病的病患。CRSwNP進一步分為ECRS和non- ECRS兩種亞型，根據先前的研究，當選取的10個高倍鏡視野(high- power fields，HPF)平均組織嗜酸粒細胞的百分比超過浸潤細胞總數的10%時，CRSwNP即被歸類為ECRS，反之則為non- ECRS[8]，見圖1。20例無慢性鼻-鼻竇炎的對照受試者，因腦脊液鼻漏、外傷及腫瘤(包括篩竇骨瘤、神經鞘瘤、腺樣囊性癌)而進行手術，在手術過程中收集其篩竇黏膜。所有活組織標本均分為兩部分:一部分用多聚甲醛固定后，用石蠟包埋固定切片進行蘇木精-伊紅 (hematoxylin- eosin，HE)染色和免疫組化(immunohistochemistry，IHC)染色;另一部分存儲在-80 ℃用于檢測Bach2蛋白和基因表達水平。本研究所有受試者的基本人口特征見表1。本研究經安徽省立醫院倫理委員會批準，每位受試者術前簽署知情同意書。

圖1 兩組鼻息肉組織中嗜酸粒細胞的表達 ×400A: 嗜酸性鼻息肉組織；B: 非嗜酸性鼻息肉組織

表1 人口特征表

1.2 方法

1.2.1受試者的臨床資料收集 收集受試者的病史、術前臨床檢查(包括鼻內鏡檢查和鼻竇CT檢查)，用Lund- Kennedy鼻內鏡評分(Endoscopy評分)、Lund- Mackay鼻竇CT評分(CT評分)及視覺量表評分(visual analogue scale，VAS評分)來評估受試者的疾病嚴重程度[1]。

1.2.2免疫組化染色 組織標本用石蠟包埋固定后，制成3 μm厚石蠟組織切片，行 HE染色和IHC染色, 檢測平均嗜酸粒細胞數和Bach2的表達情況。采用免疫組化 SP法，切片脫蠟水化、抗原修復及封閉內源性過氧化氫酶后，用抗人Bach2第一抗體(1 ∶100，美國Affinity公司) 在4 ℃條件下孵育過夜。切片第2天用HRP羊抗兔Bach2第二抗體(1 ∶200，美國Affinity公司)孵育，然后用DAB溶液顯色，復染、脫水、透明和封片。最后，由兩名研究者盲法觀察每個切片的IHC染色。從每個切片隨機選擇5個高倍鏡視野(HPF)使用Image J軟件(美國馬里蘭州Bethesda公司)計算染色切片的光密度值(integrated optical density，IOD)。

1.2.3定量逆轉錄-聚合酶鏈反應 用TRIzol試劑和氯仿試劑從活檢組織中提取總RNA，然后用Prime ScriptTMRT Master Mix(中國大連Takara公司,No.RR036A) 試劑逆轉錄成cDNA。使用設計引物和TB GreenTMPremix Ex TaqTM II(大連Takara 公司,No.RR820A)依據試劑說明書進行40個循環定量聚合酶鏈反應，以檢測Bach2的表達。設計的引物序列如表2。目標基因表達水平用2-ΔΔCT法計算。

表2 Bach2 mRNA 擴增所需的引物序列

1.2.4Western blot法 Bach2蛋白的表達用Western blot法進行檢測。用裂解液(PMSF)和勻漿法從活檢組織中提取總蛋白，檢測到蛋白質的濃度后，加樣 SDS- PAGE凝膠電泳，轉移到PVDF膜上；膜用TBS緩沖液浸潤，后用含5%脫脂奶粉的緩沖液封閉，用抗人Bach2第一抗體(1 ∶500)在4 ℃條件下過夜；之后，將膜用HRP羊抗兔Bach2第二抗體(1 ∶3 000)在室溫下孵化30 min，依次用顯影劑和定影劑進行顯影和定影；最后將膠片拍照并存檔，使用Image J軟件(美國馬里蘭州Bethesda公司)處理系統分析靶蛋白的光密度值。

2 結果

2.1 Bach2在ECRS中低表達與嗜酸粒細胞數相關如圖2A～2C中所示，Bach2主要表達于鼻腔黏膜上皮層的細胞核中。免疫組化染色光密度值定量分析表明，與 non- ECRS組比較，ECRS組中Bach2的表達顯著減少(P<0.01)。ECRS患者的 Bach2的表達與對照組比較相對較高(P<0.01)。Bach2的mRNA和蛋白在ECRS 組中的表達水平與non- ECRS組相比顯著降低(P<0.05,P<0.01)，而高于對照組(P<0.05,P<0.01)，見圖3、4。Bach2的mRNA相對表達水平與ECRS組織中的每高倍鏡視野嗜酸粒細胞數(eosinophilics/HPF)間存在負相關性(P<0.05)，見圖3。

圖2 免疫組化染色檢測 Bach2 在不同組中的表達 ×400

A: Control組；B: ECRS組；C: non- ECRS組；與non- ECRS組比較：**P<0.01；與ECRS組比較：##P<0.01

2.2 Bach2表達與疾病嚴重程度的相關性在ECRS組中，CT評分和Endoscopy評分與Bach2的表達間有一定的相關性(P<0.01，P<0.05); 而VAS評分與Bach2 表達水平間無顯著相關(P>0.05)；而在non- ECRS組中，Endoscopy評分與 Bach2的表達間有一定的相關性(P<0.01); 而CT評分及VAS評分與Bach2表達水平間無顯著相關(P>0.05,P>0.05),見圖5。

3 討論

CRS 是耳鼻喉科常見的易復發、影響生活質量的炎癥性疾病，由于其病理生理機制不清及異質性，已成為臨床研究的熱點。T細胞在CRS的眾多病理生理機制中起著至關重要的作用[2]。其中，CRSsNP主要以Th1炎癥為主，Th2炎癥與嗜酸粒細胞浸潤在CRSwNP發病機制中起著關鍵作用。對于不同類型CRS中炎癥細胞的調節機制、分化和增殖的研究，一直是不同類型CRS的分子機制的研究方向。Bach2 基因是Bach2家族成員之一，主要表達在T細胞、B細胞和神經細胞中，并調控這些細胞。最近的研究[7]表明，Bach2參與維持T細胞免疫穩態，調節效應T細胞、記憶T細胞及Treg細胞的產生和功能維持。此外，Bach2缺乏能促進Th2型免疫應答反應[9]。然而，Bach2是否參與CRS的發病機制及慢性鼻-鼻竇炎中Th2免疫反應的調節尚待闡明。

本研究中，分別用定量逆轉錄-聚合酶鏈反應、免疫組化染色和蛋白質印跡法測定Bach2在慢性鼻竇炎不同表型中的表達分布情況。實驗結果表明，Bach2主要表達在鼻黏膜上皮層，且在ECRS組息肉上皮層中表達顯著低于non- ECRS組。因此，猜想Bach2參與ECRS的發病機制與上皮的功能障礙有關，而進一步的結果顯示，ECRS組織中的eosinophilics/HPF與Bach2的表達呈負相關性，更加驗證了這一猜想，表明Bach2基因存在負向調節ECRS中嗜酸性炎癥機制。氣道上皮細胞在接觸到病原體或過敏原后能夠產生眾多炎癥介質，因此在黏膜炎癥的發生中起著重要的作用；而上皮功能障礙是鼻竇炎的發病機制之一[2]。上皮細胞構成鼻腔和鼻竇的先天免疫，通過分泌S100A8/A9、claudin- 1、occludin等蛋白，抵抗細菌的侵襲，清除潛在的病原體[2]。與CRSsNP和對照組相比，這些蛋白在CRSwNP中的表達減少，可能增加病原體入侵的風險，從而導致炎癥[10-11]。然而，本研究中尚無明確證據表明Bach2參與到這種上皮功能受損的分子機制，因此可能需要更多的研究來探索這種調節機制是否存在。Kuwahara et al[12]觀察到 Bach2敲除小鼠肺中Th2細胞因子IL- 5和IL- 13的表達增加，并且與對照小鼠相比，支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞浸潤增多。同時，Bach2敲除小鼠的胸腺中 Foxp3+CD4 T細胞數量為對照小鼠的一半，并且自發形成了特定的Th2型過敏性氣道炎癥。由于鼻黏膜細胞的上皮形態和表達方式與支氣管細胞相同，即說明氣道上皮的連續性和氣道上皮炎癥的類似分子機制[13]。這一實驗的結果也說明了 Bach2對于氣道炎癥方面的抑制作用。

圖3 Bach2在不同組中mRNA的相對表達水平及與組織中嗜酸粒細胞數的相關性

A：三組中Bach2 mRNA的相對表達水平；B：Bach2 mRNA的相對表達水平與ECRS組中每高倍鏡視野嗜酸粒細胞數的相關性；C：Bach2 mRNA的相對表達水平與non- ECRS組中每高倍鏡視野嗜酸粒細胞數的相關性；與non- ECRS組比較：*P<0.05；與ECRS組比較：#P<0.05

圖4 Western blot檢測Bach2與內參蛋白β- actin在不同組中的表達

與non- ECRS組比較：**P<0.01；與ECRS組比較：##P<0.01

Bach2可限制包括Th1、Th2和Th17細胞在內的多個Th效應細胞群的完全分化，直接調控與Th極化和分化相關的基因，如Irf4、Gata3和Ahr等[7]。最近的研究顯示，Bach2可以通過幾種不同的途徑調節Th2免疫反應和Th2細胞分化。其中關鍵一種途徑為，Bach2結合堿性亮氨酸拉鏈ATF樣轉錄因子Batf，結合Th2細胞因子調控位點，阻斷Th2 細胞因子的產生和(或)Th2細胞分化[12]。此外，Bach2敲除的小鼠體內，Batf的缺失也促進了自發性2型氣道炎癥的發展[14]。雖然有大量證據表明Bach2在調節 Th2免疫反應和維持免疫穩態方面具有關鍵作用，但具體的分子機制仍然尚未完全明確。

本研究的相關性分析結果表示，Bach2基因表達水平與疾病的嚴重程度及組織中嗜酸粒細胞數之間有一定的相關性；初步建立了Bach2與鼻竇黏膜上皮中 Th2介導的嗜酸粒細胞炎癥及ECRS疾病嚴重程度之間的聯系。這說明在ECRS的發病機制和不同CRS亞表型的形成中，Bach2發揮了重要作用。因此，可以進一步猜測通過檢測Bach2的表達，來評估2型免疫反應主導的嗜酸性炎癥程度和病變損害程度，為疾病的診治提供新的理論依據。然而，仍需要更多的臨床數據分析來驗證這一設想，以便提供更多的證據來預測CRS的嚴重程度和預后。

圖5 Bach2的相對mRNA的表達量與臨床的相關性

A：Bach2 mRNA的相對表達水平與ECRS組中CT評分、Endoscopy評分及VAS評分之間的相關性；B：Bach2 mRNA的相對表達水平與non- ECRS組中CT評分、Endoscopy評分及VAS評分之間的相關性

本研究顯示，Bach2在ECRS組中顯著低表達，而致鼻息肉上皮嗜酸性炎癥，并與臨床疾病嚴重程度相關。然而，還需要進一步的研究來探究Bach2在上皮炎癥發展過程中調節炎癥細胞的具體機制，以及是否能通過其表達水平來診療和預測ECRS的預后。