mTOR抑制劑通過mTOR通路介導(dǎo)胰腺癌順鉑耐藥的機(jī)制研究

朱小長，陶連元，杜瀛瀛，時 云

胰腺癌(pancreatic carcer，PC)是一種常見的消化道腫瘤，其惡化程度高、病程短，具有早期不易確診、手術(shù)治愈率低、5年生存率不足1%的特點(diǎn)，是預(yù)后效果最差的惡性腫瘤之一[1]。目前PC的化療方案主要以鉑類藥物為基礎(chǔ)，順鉑(cis- dichlorodiamine platinum，DDP)是代表藥物之一。DDP屬于細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥物，與PC腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合并抑制其復(fù)制轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[2]。大量研究[3]表明PC細(xì)胞已經(jīng)對DDP產(chǎn)生耐藥性，雷帕霉素哺乳動物靶點(diǎn)(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路改變是原因之一。雷帕霉素(rapamycin，RAPA)是一種新型高效低毒的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，能抑制mTOR信號通路，減緩腫瘤細(xì)胞對DDP的耐藥性[4]。該研究選取3種PC細(xì)胞株，旨在進(jìn)一步研究RAPA通過mTOR信號通路抑制PC腫瘤細(xì)胞作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑PANC- 1細(xì)胞、BxPC- 3細(xì)胞、SW1990細(xì)胞購自中國北京細(xì)胞系資源庫；RAPA購自海門市碧云天生物技術(shù)研究所；DDP、四甲基偶氮唑鹽(methylthio tetrazole，MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；遷移(Transwell)小室、抗磷脂酰肌醇3- 激酶(phosphatidylinositol 3- kinase，PI3K)、磷酸化磷酯酰肌醇- 3激酶(phosphorylated phosphatidylinositol- 3- kinase，p- PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p- AKT)、mTOR、磷酸化雷帕霉素哺乳動物靶點(diǎn)(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p- mTOR)、β- actin、羊抗兔Ig二抗等抗體、胰蛋白酶、青霉素鏈霉素雙抗均購自美國賽默飛世爾科技公司；RPMI- 1640、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司。

1.2 實(shí)驗方法用含10%的胎牛血清的達(dá)爾伯克必需培養(yǎng)基(dulbecco minimum essential medium，DMEM)(PANC- 1)或RPMI- 1640(BxPC- 3、SW1990)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。

1.2.1劃痕修復(fù)方法 3種細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合度80%，劃痕、拍照，去除培養(yǎng)基，加2.5%血清培養(yǎng)基，用含20 mg/L DDP或20 mg/L DDP+10 μmol/L RAPA的血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h拍照。劃痕修復(fù)率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.2Transwell方法 用胰蛋白酶消化細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液清洗2次，加無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至15×104個/ml，上室接種200 μl細(xì)胞液，下室加600 μl 10%的胎牛血清，用20 mg/L DDP或20 mg/L DDP+10 μmol/L RAPA處理細(xì)胞12 h，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.3MTT方法 胰蛋白酶消化細(xì)胞，接種于96孔板，每孔5×103個細(xì)胞，孵育12 h，細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，加入DDP及0、5、10、20 μmol/L RAPA血清培養(yǎng)基200 μl，每24 h換液1次，48 h后加入MTT 20 μl，培養(yǎng)4 h，去除培養(yǎng)基加入DMSO 150 μl，避光搖10 min，取100 μl，490 nm檢測光密度(optical density，OD)值，計算DDP對細(xì)胞株的半抑制濃度(50% inhibiting concentration，IC50)。每組6孔，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4Western blot方法 取總蛋白，上樣10 μg，SDS- PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)印PVDF，牛血清白蛋白封閉1 h，加一抗，4 ℃過夜，TBST洗滌3次，加二抗孵育2 h，加ECL發(fā)光液，拍照，分析條帶灰度。

2 結(jié)果

2.1 RAPA抑制胰腺癌細(xì)胞株遷移能力劃痕實(shí)驗顯示，單用DDP 時，PANC- 1、BxPC- 3、SW1990三種耐DDP細(xì)胞株均具有較強(qiáng)的遷移能力，PANC- 1的遷移能力最強(qiáng)，其次為SW1990、BxPC- 3。聯(lián)合RAPA，3株耐藥株的遷移能力均顯著低于未加RAPA(P<0.01)，見表1、圖1。

表1 RAPA抑制胰腺癌細(xì)胞株遷移能力

2.2 RAPA抑制胰腺癌細(xì)胞株侵襲能力Transwell實(shí)驗顯示：單用DDP，PANC- 1、BxPC- 3、SW1990三種耐DDP細(xì)胞株均具有較強(qiáng)的侵襲能力，聯(lián)合RAPA，3株耐藥株的侵襲能力顯著降低(P<0.01)，見表2、圖2。

表2 RAPA抑制胰腺癌細(xì)胞株侵襲能力

2.3 RAPA降低胰腺癌細(xì)胞株IC50劃痕修復(fù)實(shí)驗及Transwell實(shí)驗顯示:10 μmol/L RAPA能抑制PANC- 1、BxPC- 3、SW1990耐藥株的遷移能力和侵襲能力，故進(jìn)一步設(shè)計DDP聯(lián)合不同濃度梯度的RAPA，考察DDP對3種細(xì)胞株的IC50的變化。結(jié)果顯示：未加RAPA時，3株細(xì)胞株的IC50較高，加入5、10、20 μmol/L RAPA，3株細(xì)胞株的IC50顯著降低(P<0.01)，見表3。

2.4 RAPA抑制PANC- 1細(xì)胞株P(guān)I3K/AKT/mTOR通路的蛋白表達(dá)Western blot實(shí)驗顯示：單用DDP時，PANC- 1耐藥株的PI3K、p- PI3K、AKT、p- AKT、mTOR、p- mTOR蛋白表達(dá)量較高，聯(lián)合加入5、10、20 μmol/L RAPA后，PANC- 1耐藥株的PI3K、p- PI3K、AKT、p- AKT、mTOR、p- mTOR蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，見圖3。

圖1 劃痕修復(fù)實(shí)驗結(jié)果 ×40

圖2 Transwell實(shí)驗結(jié)果 ×100

組別DDPDDP+RAPA(5 μmol/L)DDP+RAPA(10 μmol/L)DDP+RAPA(20 μmol/L)t值P值PANC-142.31±4.6834.59±4.22??23.38±4.24??##13.78±3.11??##ΔΔ55.90<0.01BxPC-337.58±4.2430.24±3.52??18.34±4.01??##10.36±3.24??##ΔΔ62.01<0.01SW199033.69±3.5727.21±3.28??18.34±3.21??##12.24±3.14??##ΔΔ49.36<0.01

與對照組比較：**P<0.01；與低劑量組比較：##P<0.01；與中劑量組比較：ΔΔP<0.01

圖3 RAPA對 PANC- 1 細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

A:DDP;B:DDP+RAPA(5 μmol/L);C:DDP+RAPA(10 μmol/L);D:DDP+RAPA(20 μmol/L)；與DDP組比較：**P<0.01；與DDP+RAPA (5 μmol/L)組比較：##P<0.01；與DDP+RAPA(10 μmol/L)組比較：ΔΔP<0.01

2.5 RAPA抑制BxPC- 3細(xì)胞株P(guān)I3K/AKT/mTOR通路的蛋白表達(dá)Western blot實(shí)驗結(jié)果顯示：僅加入20 mg/L DDP 時，BxPC- 3耐藥株的PI3K、p- PI3K、AKT、p- AKT、mTOR、p- mTOR蛋白表達(dá)量較高，聯(lián)合加入5、10、20 μmol/LRAPA后，BxPC- 3耐藥株的PI3K、p- PI3K、AKT、p- AKT、mTOR、p- mTOR蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，見圖4。

2.6 RAPA抑制SW1990細(xì)胞株P(guān)I3K/AKT/mTOR通路的蛋白表達(dá)Western blot實(shí)驗顯示：僅加入20 mg/L DDP 時，SW1990耐藥株的PI3K、p- PI3K、AKT、p- AKT、mTOR、p- mTOR蛋白表達(dá)量較高，聯(lián)合加入5、10、20 μmol/L RAPA，SW1990耐藥株的mTOR蛋白表達(dá)量降低，三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；SW1990耐藥株的PI3K、p- PI3K、AKT、p- AKT、p- mTOR蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，見圖5。

3 討論

研究[5]表明，腫瘤細(xì)胞的化藥耐藥是導(dǎo)致化療失敗的重要原因，根據(jù)耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制，可分為原發(fā)性耐藥(primary drug resistance，PDR)和多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，PDR 僅對誘導(dǎo)藥物產(chǎn)生耐藥，MDR不僅對誘導(dǎo)藥物產(chǎn)生耐藥，還對結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制不同的藥物產(chǎn)生耐藥，是腫瘤化療失敗的首要原因，抑制多藥耐藥蛋白，能增加DDP 對耐藥基因DNA的損傷。細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制最主要有：① 細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降：腫瘤細(xì)胞膜改變使藥物不易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，或腫瘤細(xì)胞增加藥物外排，最終使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降，不能達(dá)到最低有效濃度[6]；② 腫瘤細(xì)胞凋亡程序改變，例如，腫瘤細(xì)胞損傷激活細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)機(jī)制，改變信號通路相關(guān)基因活性[7-8]。

圖4 RAPA對 BxPC- 3 細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

A：DDP組；B：DDP+RAPA (5 μmol/L)；C：DDP+RAPA(10 μmol/L)；D：DDP+RAPA (20 μmol/L)；與DDP組比較：**P<0.01；與DDP+RAPA (5 μmol/L)組比較：##P<0.01；與DDP+RAPA(10 μmol/L)組比較：ΔΔP<0.01

mTOR信號通路主要由PI3K、AKT、mTOR等組成，影響細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等生理活動。胰島素樣生長因子作用，激活PI3K，使磷脂酰肌醇4,5- 二磷酸(phosphatidylinositol 4,5- diphosphate，PIP2)磷酸化生成PIP3，PIP3促使AKT在細(xì)胞膜表面被脯氨酸依賴性激酶磷酸化形成p- AKT，使處于抑制狀態(tài)的mTOR被激活。磷酸化的p- mTOR激活下游相關(guān)分子，促進(jìn)細(xì)胞翻譯、合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等生理功能[9]。有研究[10]證實(shí)mTOR信號通路可以影響腫瘤細(xì)胞的生長代謝、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力。有學(xué)者從DDP 耐藥肺癌細(xì)胞株A549/順二氨基二氯鉑中發(fā)現(xiàn)AKT1呈高表達(dá)，抑制AKT1表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對DDP 的耐藥[11]。Wang et al[12]和Zhang et al[13]研究表明，CA916798基因編碼的蛋白存在于mTOR信號通路的3個磷酸化位點(diǎn)，mTOR通路可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控該基因的表達(dá)，誘導(dǎo)DDP耐藥。

圖5 RAPA對SW1990細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

A：DDP組；B：DDP+RAPA (5 μmol/L)；C：DDP+RAPA(10 μmol/L)；D：DDP+RAPA (20 μmol/L)；與DDP組比較：**P<0.01；與DDP+RAPA (5 μmol/L)組比較：##P<0.01；與DDP+RAPA(10 μmol/L)組比較：ΔΔP<0.01

本研究顯示：PANC- 1、BxPC- 3、SW1990 3種PC細(xì)胞株均對DDP耐藥，單用DDP時，3種細(xì)胞株均具有很強(qiáng)的細(xì)胞遷移能力和侵襲能力，IC50較高；聯(lián)用RAPA后，3種細(xì)胞株的遷移能力和侵襲能力顯著下降(P<0.01)，這與朱方 等[14]的研究結(jié)果一致。當(dāng)加入不同濃度的RAPA后，3種細(xì)胞株的生存率均明顯降低，其IC50顯著下降(P<0.01)，這提示RAPA可以增強(qiáng)耐藥株對DDP的敏感性。進(jìn)一步的Western blot 實(shí)驗檢測顯示：RAPA可下調(diào)PANC- 1及BxPC- 3細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR蛋白的表達(dá)，抑制PI3K、AKT、mTOR磷酸化，雖然對SW1990的mTOR表達(dá)的影響較弱，但仍可顯著抑制相關(guān)蛋白磷酸化，表明RAPA可能是通過抑制mTOR通路逆轉(zhuǎn)PC細(xì)胞株DDP 耐藥機(jī)制。mTOR有mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合體，均對腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、生長、轉(zhuǎn)移等有不同的效應(yīng)。蔡鵬濤 等[15]研究表明，mTORC2在耐藥細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于敏感株，mTORC1在敏感細(xì)胞中的活性更高，但是在兩種細(xì)胞中，mTOR信號通路均處于高度活化狀態(tài)，提示mTORC1和mTORC2之間可能存在動態(tài)平衡，當(dāng)上游信號發(fā)生改變時，將使mTORC1向mTORC2轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生耐藥性，這也可能是本研究中RAPA對SW1990耐藥株的mTOR蛋白抑制不明顯的原因，表明可能還存在其他通路影響mTOR蛋白的表達(dá)，其對DDP 產(chǎn)生耐藥的具體機(jī)制還值得進(jìn)一步研究。