FXR激動劑奧貝膽酸抑制吉非替尼所致的肺纖維化機制的研究

龐 昶，林樹無

肺癌發病率逐年上升，已經成為全世界范圍內發病率以及病死率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌占了80%～90%[1]。隨著近年來靶向治療的進展，吉非替尼療效明顯優于常規化療[2]，但仍有發生嚴重的藥物相關性肺纖維化的風險。肺纖維化進行性加重，呼吸困難是其最常見和最突出的臨床癥狀，其5年生存率為30%～50%[3]。

目前，第一種法尼醇X受體(farnesoid X receptor，FXR) 靶向藥物奧貝膽酸(obeticholicacid，OCA)已被宣稱有效治療肝纖維化[4]。轉化生長因子- β1(transforming growth factor- β1，TGF- β1)是肺纖維化形成的關鍵因子[5]。α- 平滑肌肌動蛋白(α- smooth muscle actin，α- SMA)參與了肌成纖維細胞的轉化及心肌纖維化的發生[6]。Smad 蛋白家族的Smad2/3、Smad7是TGF- β1特異的細胞內信號轉導分子[7]。奧貝膽酸減少肝臟纖維化與降低α- SMA、TGF- β1蛋白等纖維化指標密切相關[8]，就是說奧貝膽酸可以下調α- SMA、TGF- β1等肺纖維化指標，或許是奧貝膽酸可能治療肺間質纖維化的一個機制。該研究應用細胞組和動物組實驗檢測TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白的表達水平，初步探討奧貝膽酸抑制肺纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞組實驗材料人肺成纖維細胞HFL1細胞(上海滬震生物科技有限公司)； 1640培養基(美國HyClone生物技術公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus顯微鏡公司)；高壓滅菌鍋(日本三洋公司MLS- 3750)；無菌操作臺(SW-CJ-1F型，蘇州安泰空氣技術有限公司)；吉非替尼(生產批號：H20090759，英國Tocris Bioscie公司，200 mg/kg灌胃)；奧貝膽酸(連云港騰發生物科技有限公司，美國Intercept公司生物制藥有限公司生產，5 mg/kg 灌胃)；博來霉素(生產批號：H20051232，上海偉進生物科技有限公司，5 mg/kg向氣管內注入建模)；小型高速離心機(德國Eppendorf AG 22331 Hamburg)；TGF- β1 ELISA試劑盒、α- SMA ELISA試劑盒、Smad2/3 ELISA試劑盒、Smad7 ELISA試劑盒(武漢優爾生商貿有限公司)；兔抗鼠Smad2/3一抗、兔抗鼠Smad7一抗、兔抗鼠TGF- β1一抗、兔抗鼠α- SMA一抗、兔抗鼠β- actin一抗、羊抗兔二抗(美國Cell Signaling Technology生物公司)。共設置3個實驗組[9]：對照組、吉非替尼組、奧貝膽酸+吉非替尼組。將吉非替尼2.5 μmol/L, 奧貝膽酸5 mg/L各3 ml分組與HFL1細胞共培養6 d，采用ELISA方法對TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量進行檢測。

1.2 實驗動物及分組健康清潔級SD雄性大鼠 60只，體質量180～220 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號: SCXK(京)- 2017-0011。實驗動物飼養溫度(23±1)℃，相對濕度(50±5)%。采用隨機數字表法將60只雄性SD大鼠隨機分為4個實驗組[9]：對照組、博來霉素組、吉非替尼+博來霉素、吉非替尼+博來霉素+奧貝膽酸組。

1.3 模型制備及給藥對照組向氣管內注入蒸餾水50 μl，余各組實驗動物均向氣管內注入以蒸餾水稀釋的博來霉素(5 mg/kg)溶液50 μl建立肺纖維化模型。注射后迅速沿縱軸旋轉，使藥物在肺內均勻分布。博來霉素+吉非替尼組2 h后給予吉非替尼200 mg/kg、2 ml灌胃。吉非替尼+博來霉素+奧貝膽酸組2 h后給予吉非替尼200 mg/kg、2 ml灌胃，4 h后給予奧貝膽酸5 mg/kg、2 ml灌胃治療。

1.4 動物組實驗TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白表達的測定實驗日期以動物灌胃造模試驗當天為實驗0 d，實驗第1、3、7、14、21天4組每組分別處死3只大鼠，采用ELISA方法對第1、3、7、14、21 d大鼠血漿中TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白表達進行檢測。采用Western blot方法檢測21 d大鼠肺組織勻漿中TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白表達情況。

1.5 肺組織病理學評價選擇實驗第1、3、7、14、21天各組大鼠肺組織剪取部分肺葉，做成切片進行HE染色，在100倍光鏡下觀察肺組織形態變化。

2 結果

2.1 細胞組實驗奧貝膽酸對各組TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量的影響與對照組比較，吉非替尼組及奧貝膽酸+吉非替尼組TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表達均有所增加，Smad7蛋白的表達逐漸下降，差異有統計學意義(P<0.01)。奧貝膽酸+吉非替尼組TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表達各時點均明顯低于吉非替尼組，但仍高于對照組，Smad7蛋白的表達顯著高于吉非替尼組，但仍低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 細胞組實驗各組TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量測定

與對照組比較：**P<0.01；與吉非替尼組比較：##P<0.01

2.2 動物組奧貝膽酸對各組大鼠血漿中TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量的影響動物組實驗中，與對照組比較，博來霉素組、吉非替尼+博來霉素組、吉非替尼+博來霉素+奧貝膽酸組均隨著時間延長，TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表達逐漸升高，各時點均明顯高于對照組，Smad7蛋白的表達逐漸下降，各時點均明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。吉非替尼+博來霉素+奧貝膽酸組TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表達各時點均明顯低于博來霉素組及吉非替尼+博來霉素組，但仍高于對照組，Smad7蛋白的表達顯著高于博來霉素組及吉非替尼+博來霉素組，但仍低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

2.3 動物組奧貝膽酸對各組大鼠肺組織勻漿中第21天TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量的影響與對照組比較，博來霉素組、博來霉素+吉非替尼組及博來霉素+吉非替尼+奧貝膽酸組21 d TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表達均有所增加，Smad7均有所下降，差異有統計學意義(P<0.01)。博來霉素+吉非替尼+奧貝膽酸組21 d TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白表達低于博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組，但仍高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。博來霉素+吉非替尼+奧貝膽酸組21 d Smad7蛋白表達明顯高于博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組，但仍低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

表1 各組大鼠血漿中TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量比較

與對照組比較：**P<0.01；與博來霉素組比較：##P<0.01；與吉非替尼+博來霉素組比較：▽▽P<0.01

2.4 奧貝膽酸對各組大鼠肺組織病理形態學的影響肺組織病理切片HE染色結果示對照組結構清晰，未見明顯形態改變、炎癥浸潤和纖維化。與對照組大鼠肺組織相比，博來霉素+吉非替尼組大鼠肺水腫，明顯的纖維組織增生。博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組早期(1～7 d)病理特征為肺充血、肺水腫及炎性細胞浸潤。博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組14 d后，肺泡結構遭到破壞，纖維結締組織增多，肺泡壁逐漸增厚。博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組21 d后，膠原沉積，肺組織彌漫性肺纖維化。與博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組大鼠肺組織相比，博來霉素+吉非替尼+奧貝膽酸組病理學改變有顯著改善，肺組織纖維化程度顯著減輕。見圖 3。

3 討論

非小細胞肺癌是肺癌中較常見的類型，由于早期無典型癥狀，故多數患者就診時已為晚期，錯失手術最佳時機，而化療成為了晚期非小細胞肺癌首選的治療方式[10]。吉非替尼是一種分子靶向藥物，可抑制腫瘤生長，全球因吉非替尼所致的間質性肺炎平均發病率約1%[11]。現有的治療方法不能有效地緩解病情的發展和使肺纖維化逆轉，迫切需要新的治療藥物減緩肺纖維化進展。

圖2 動物組中各組21 d TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白的表達水平

A：對照組；B：博來霉素+吉非替尼+奧貝膽酸組；C：博來霉素組；D：博來霉素+吉非替尼組；與對照組比較：**P<0.01；與博來霉素組比較：##P<0.01；與吉非替尼+博來霉素組比較：▽▽P<0.01

圖3 各組各時間段大鼠肺組織病理變化HE ×100

A：對照組；B：博來霉素+吉非替尼+奧貝膽酸組；C：博來霉素組；D：博來霉素+吉非替尼組

在纖維化進程中，會受到TGF- β1與下游Smad 蛋白家族信號通路的調控[12]。Smad3 促進纖維化的形成，Smad7 卻是TGF- β1 信號轉導途徑的主要抑制性蛋白[13]。已經有多個研究[14]證實單純用吉非替尼灌胃小鼠不能引起肺組織明顯的纖維化改變。博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化模型目前已較成熟，故使用博萊霉素誘導大鼠肺纖維化后，予吉非替尼及奧貝膽酸進行干預，觀察其對纖維化效果的影響，是一種高效、切實可行的辦法。本研究選擇TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7作為觀察指標。結果表明，博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白表達均有所增加，Smad7蛋白表達均有所下降，促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，肺纖維化程度加重。博來霉素+吉非替尼+奧貝膽酸組與博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組比較TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白表達均降低，Smad7蛋白的表達均升高，可見奧貝膽酸可以拮抗吉非替尼，達到降低肺纖維化的程度。本實驗中肺組織病理學鏡下觀察發現，博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組肺泡內可見大量膠原片狀，絮狀沉積，纖維灶融合。而奧貝膽酸治療組可見肺泡內膠原沉積顯著減少，肺泡破壞減輕，無明顯纖維灶融合?？梢妸W貝膽酸可以抑制吉非替尼誘導的肺纖維化病理過程。綜上可見，加入奧貝膽酸干預后TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白含量表達均降低，Smad7蛋白表達均升高，同時大鼠肺組織病理纖維化程度降低，證實奧貝膽酸可以通過干預TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7信號對吉非替尼導致的肺纖維化產生保護作用。本實驗僅為初步研究，后續還可以通過研究溶血磷脂酸(LPA)、丙二醛(MDA) 、超氧化物歧化酶(SOD) 、過氧化氫酶(CAT)、還原性谷胱甘肽(GSH) 、Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白等肺纖維化相關指標，以進一步求證奧貝膽酸對吉非替尼誘導的肺纖維化的作用。

吉非替尼近年來廣泛用于局部晚期與轉移性NSCLC的治療。肺間質纖維化是吉非替尼治療過程中少見但致命的不良反應。在既往的研究中，顯示吉非替尼抗腫瘤同時具有抑制氣管上皮細胞表皮生長因子受體的表達功能，影響其受損后的修復，導致免疫反應失控，產生間質性肺炎[15]。尋找合適的抗肺纖維化藥物和阻止肺纖維化疾病的策略，己經持續了好幾十年，但是理想的治療手段還沒有找到。本實驗證實奧貝膽酸能夠減弱吉非替尼誘導的肺纖維化程度，為肺纖維化的治療提供一種新的思路，創造良好的社會價值及醫療價值。