氯喹抑制阿司匹林誘導的自噬增強其體外抗肝細胞癌作用

王夢琳, 楊 慧, 金 娟

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，我國肝癌發病率及死亡率高于同期世界平均水平[1]。阿司匹林(aspirin，ASP)是傳統的非甾體抗炎藥，2016年作為直結腸癌一級預防藥列入指南[2]，長期服用ASP可以降低發生結腸癌的風險、抑制腫瘤的轉移及改善直結腸癌患者術后生存率，對于其他癌癥如乳腺癌、胃癌、肝癌等的生長轉移也有一定抑制作用[3]。自噬是真核細胞中廣泛存在的現象，具有高度的保守性，涉及一系列連續事件，包括雙層膜的形成、伸長、囊泡的成熟及將包裹的細胞質中受損的蛋白及受損的細胞器運輸至溶酶體降解，在營養不足、生長因子缺乏、缺氧等應激狀態下，細胞內的自噬啟動，對維持細胞內環境的穩態及細胞正常生長增殖有重要作用[4]。肝癌發生發展中自噬具有雙重作用，在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的初始階段抑制腫瘤的形成，在隨后的發展階段則促進腫瘤形成，并且自噬和肝癌細胞藥物抵抗有關[5]。該實驗旨在探究ASP對肝癌HepG2、SMMC- 7721細胞生長增殖作用及ASP對肝癌HepG2、SMMC- 7721細胞作用與自噬的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人肝癌HepG2、SMMC- 7721細胞購于中國科學院上海細胞庫；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；高糖DMEM培養基購自美國Hyclone公司；ASP購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯喹(chloroquine,CQ)、二甲基亞砜(DMSO)及MTT購自美國Sigma公司；兔抗LC3單克隆抗體及兔抗mTOR單克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗C9orf72多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗AMPK單克隆抗體購自蘇州百奇生物科技有限公司；小鼠抗β- actin、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG及辣根酶標記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗儀器超純水儀(型號：NW 1 CUF)、三氣培養箱(型號：HF 100)購自上海力康生物醫療科技控股有限公司；超凈工作臺(型號：SW- CI- 2F)購自中日合資蘇州安泰空氣技術有限公司；Counter Star全自動細胞計數儀(型號：IC 1 000)購自上海睿鈺生物科技有限公司；Muliskan GO酶標儀(型號：1510)購自美國Thermo Fisher科技公司；電泳儀(型號：PowerPacTMBasic)購自美國Bio- Rad公司；顯影儀(型號：4 600 Mini)購自上海歐翔科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養 HepG2、SMMC- 7721細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的高糖DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。每2 d換液1次，細胞匯合度達80%～90%時用0.25%胰酶進行消化與傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3.2MTT法檢測細胞增殖活性 取對數生長期細胞，常規消化離心收集細胞，接種于96孔板，每孔5 000個，置于37 ℃培養箱中培養過夜，棄去原有培養液，PBS輕洗2遍，加入ASP(0、1.25、2.5、5、10、20 mmol/L)、40 μmol/L CQ及含有CQ的不同濃度ASP(1.25、2.5、5 mmol/L)的DMEM溶液，每孔200 μl，每組設5個復孔，37 ℃培養箱孵育24 h后，避光條件下每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml) 溶液，繼續孵育4 h后，棄去原有培養液，每孔加入DMSO 150 μl，室溫下搖床上振動15 min溶解結晶，490 nm波長檢測吸光度(OD)值。細胞增殖率(%)=實驗組OD490/對照組OD490×100%。

1.3.3細胞克隆形成實驗 取對數生長期細胞，常規消化收集細胞，接種于6孔板中，每孔1 000個，37 ℃培養箱培養過夜，貼壁后，更換聯合或不聯合CQ的含不同濃度ASP(1.25、2.5、5 mmol/L)的DMEM繼續培養，同時設不含藥物的DMEM對照組，48 h后棄去含藥培養液，更換成正常培養基繼續培養10 d。棄上清液，PBS漂洗2次，用含有0.1%結晶紫的4%多聚甲醛溶液固定染色30 min，緩慢流水輕輕沖洗洗去染液，倒置室溫干燥。拍照，計數肉眼可見克隆數?？寺⌒纬陕?實驗組克隆數/對照組克隆數×100%。

1.3.4Western blot法測定蛋白表達 收集對數生長期細胞，接種于6孔板中，分組同1.3.3，細胞匯合度達70%～80%時，更換不同含藥DMEM培養液，8 h后冰上裂解細胞提取細胞蛋白，BCA蛋白定量，變性后蛋白經SDS- PAGE電泳、濕轉至PVDF膜后用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h，TBST漂洗后，化學發光法顯影，Image J分析條帶灰度值。

2 結果

2.1 ASP及聯合CQ對HepG2、SMMC- 7721細胞增殖的影響MTT結果顯示，不同濃度ASP處理細胞后，與對照組相比ASP 1.25、2.5 mmol/L組對細胞增殖無抑制作用，但隨著ASP濃度增加其抑制作用增強，細胞增殖活性顯著降低(P<0.001，FHepG2=93.52，FSMMC- 7721=188.1)。ASP聯合自噬抑制劑CQ后，與單獨使用ASP(1.25、2.5、5 mmol/L)比較，細胞增殖活性顯著降低(P<0.001，FHepG2=83.59，FSMMC- 7721=102.0)。見圖1。

圖1 ASP及聯合自噬抑制劑CQ后對肝癌細胞增殖的影響

A：HepG2；B：SMMC- 7721；與對照組比較：***P<0.001；與ASP 1.25 mmol/L組比較：###P<0.001；與ASP 2.5 mmol/L組比較：△△△P<0.001；與ASP 5 mmol/L組比較：▽▽▽P<0.001

2.2 ASP降低HepG2、SMMC- 7721細胞克隆形成細胞克隆形成實驗結果顯示，與對照組相比，ASP(1.25、2.5、5 mmol/L)抑制細胞克隆形成(PHepG2<0.01，PSMMC- 7721<0.001，FHepG2=9.242，FSMMC- 7721=94.10)，ASP聯合自噬抑制劑CQ后兩種細胞克隆形成率與單獨使用ASP(1.25、2.5、5 mmol/L)組相比進一步降低(P<0.001，FHepG2=64.56，FSMMC- 7721=158.00)。見圖2。

2.3 ASP及聯合CQ后對細胞AMPK、mTOR、LC3、C9orf72表達的影響ASP(1.25、2.5、5 mmol/L)處理兩種肝癌細胞后同對照組相比，AMPK表達增加(PHepG2<0.01，PSMMC- 7721<0.5，FHepG2=13.27，FSMMC- 7721=5.112)，mTOR表達降低(PHepG2<0.001，PSMMC- 7721<0.001，FHepG2=31.52，FSMMC- 7721=45.81)，C9orf72表達增加(PHepG2<0.001，PSMMC- 7721<0.001，FHepG2=34.44，FSMMC- 7721=22.01)，HepG2細胞中LC3 Ⅱ/Ⅰ比值增加(P<0.01，F=8.328)，SMMC- 7721細胞中LC3 Ⅱ/Ⅰ比值增加不明顯。聯合自噬抑制劑CQ后同單獨使用對應ASP 1.25、2.5、5 mmol/L組相比，LC3 Ⅱ表達、LC3 Ⅱ/Ⅰ比值增加(PHepG2<0.001、0.001、0.01，FHepG2=28.65；PSMMC- 7721<0.01、0.05、0.01，FSMMC- 7721=11.12)，SMMC- 7721細胞中AMPK表達降低(P<0.001、0.001、0.01，F=23.64)，HepG2細胞中聯合CQ的ASP 2.5、5 mmol/L組AMPK表達降低(P<0.01，F=12.77)，ASP聯合自噬抑制劑CQ處理后的HepG2細胞中C9orf72表達增加(P<0.05、0.01、0.001，F=60.44)。見圖3、表1、2。

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，2010年全國肝癌發病率占全國癌癥發病率第三位，顯著高于同期全球、亞洲及發達地區；2012年我國肝癌患者死亡人數達38萬，占全球肝癌死亡人數的51%，占同期全國癌癥死亡總數的17.4%[1]。肝細胞癌是肝癌中最常見的一種，在HCC發生發展中自噬起著雙重作用，在損傷階段，酒精、病毒感染等因素可激活肝細胞中的自噬，敲除自噬相關基因(ATG)后，自噬發生受抑制，肝損傷增加，肝細胞在丙型肝炎病毒(HCV)的作用下更容易發生惡變[5]；而腫瘤形成后，自噬可以使肝癌細胞在缺血、缺氧環境中得以生存[6]。自噬的發生與肝癌細胞藥物抵抗有關，抑制自噬，肝癌細胞對抗癌藥物的敏感性增加，目前已有自噬抑制劑CQ、羥氯喹與抗癌藥物聯用進行的臨床試驗[5]。CQ是一種常見的自噬抑制劑，通過抑制自噬體與溶酶.體融合及融合后物質降解抑制自噬[7]。

圖2 ASP及聯合自噬抑制劑CQ后對肝癌細胞增殖的影響及統計分析

A：HepG2；B：SMMC- 7721；C：HepG2細胞克隆形成率；D：SMMC- 7721 細胞克隆形成率；與對照組比較：*P<0.01，**P<0.01，***P<0.001；與ASP 1.25 mmol/L組比較：###P<0.001；與ASP 2.5 mmol/L組比較：△△△P<0.001；與ASP 5 mmol/L組比較：▽P<0.05，▽▽▽P<0.001)

圖3 ASP及聯合自噬抑制劑CQ后肝癌HepG2(A)、SMMC- 7721(B)細胞內AMPK、mTOR、C9orf72、 LC3蛋白的表達

組別AMPKmTORC9orf72LC3Ⅱ/Ⅰ對照1.000±0.2001.000±0.0831.000±0.0431.508±0.172ASP 1.25 mmol/L1.804±0.3100.503±0.083???1.345±0.052???2.649±0.594?ASP 2.5 mmol/L3.551±0.824??0.767±0.097?1.333±0.063??2.587±0.300?ASP 5 mmol/L2.735±0.544??0.430±0.050???0.950±0.0833.110±0.437???CQ+ASP 1.25 mmol/L2.875±0.591??#0.677±0.082??#1.581±0.073???##5.187±0.358???###CQ+ASP 2.5 mmol/L1.274±0.076△△0.864±0.0491.546±0.107???△5.073±0.798???△△△CQ+ASP 5 mmol/L1.476±0.186▽▽0.216±0.050???▽▽2.232±0.179???▽▽▽4.460±0.165???▽▽

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與ASP 1.25 mmol/L組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與ASP 2.5 mmol/L組比較：△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；與ASP 5 mmol/L組比較：▽▽P<0.01，▽▽▽P<0.001

表2 各組SMMC- 7721細胞中AMPK、mTOR、C9orf72蛋白的表達及LC3 Ⅱ/Ⅰ比值

與對照組比較:*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與ASP 1.25 mmol/L組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與ASP 2.5 mmol/L組比較：△P<0.05，△△△P<0.001；與ASP 5 mmol/L組比較：▽▽P<0.01

mTOR是真核細胞啟動自噬中一個關鍵的抑制性調節因子，受多條通路調節，激活mTOR的通路如Akt和MAPK信號通路，負調控mTOR的通路如AMPK和p53信號通路。mTOR抑制劑雷帕霉素作為常用自噬誘導劑顯示出了抗腫瘤作用[8]。人9號染色體72號開放閱讀框(Chromosome 9 open reading frame 72，C9orf72)基因非編碼區中GGGGCC序列病理性重復性擴增是額顳葉癡呆(FTD)和肌萎縮性脊髓硬化癥(ALS)的主要遺傳原因[9]，其編碼的C9orf72蛋白功能尚不明確。目前研究發現C9orf72與Rab1a和 ULK1復合物相互作用參與調節自噬起始[10]，與SMCR8和WDR41結合調節自噬溶酶體途徑，在C9orf72-/-小鼠中自噬受損[11]。但Ugolino et al[12]研究認為，敲低C9orf72后通過下調mTOR、活化TFEB信號，增強自噬活性。以上提示了C9orf72在自噬發生過程中發揮多重作用。

ASP抗HCC作用被廣泛研究，小劑量服用ASP可以降低患HCC的風險，乙型肝炎病毒相關HCC患者行肝切除術，術后使用ASP可有效改善患者預后[13]，小劑量ASP誘導HepG2細胞自噬，降低抗HCC作用[14]。本研究顯示，ASP(1.25、2.5、5 mmol/L)抗肝癌HepG2及SMMC- 7721細胞作用不明顯，聯合自噬抑制劑CQ后抑制作用增加。ASP處理兩種細胞后，細胞中C9orf72、AMPK表達增加， mTOR表達降低，LC3 Ⅱ/Ⅰ比值增加，提示ASP(1.25、2.5、10 mmol/L)可能通過AMPK/mTOR通路激活自噬，C9orf72也可能參與其中；聯合自噬抑制劑后，CQ破壞自噬體和溶酶體融合及隨后內容物的降解使自噬體細胞內堆積，LC3 Ⅱ表達增加。綜上所述，CQ可以通過抑制自噬，增加ASP體外抗肝癌細胞的作用，但其機制還需進一步研究。