雞胚成纖維細胞cDNA文庫構建及其與禽呼腸孤病毒σA相互作用宿主蛋白的篩選

葉麗娜 謝芝勛 謝麗基 王盛 鄧顯文 謝志勤 范晴 黃嬌玲 曾婷婷 張艷芳 羅思思

摘要：【目的】構建雞胚成纖維細胞（CEF）的cDNA文庫并篩選與禽呼腸孤病毒（ARV）σA蛋白相互作用的宿主蛋白，為揭示互作蛋白對ARV復制及凋亡的分子調控機制打下基礎。【方法】采用TRIzol法提取CEF細胞總RNA，以SMART技術和LD-PCR合成雙鏈cDNA（ds cDNA），ds cDNA和pGADT7-Rec共轉化Y187酵母感受態細胞，構建cDNA文庫;將pGBKT7-σA誘餌質粒轉至Y2HGold酵母感受態細胞中，并與構建的cDNA文庫進行酵母雙雜交篩選，篩選出的候選文庫菌經質粒提取后與pGBKT7-σA誘餌質粒再共轉化Y2HGold酵母菌，篩選出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固體培養基上生長且明顯變藍的菌落，最后提取藍色酵母菌質粒進行測序分析。【結果】構建的CEF細胞cDNA文庫庫容為1.6×106 CFU，文庫滴度為3.1×108 CFU/mL，插入片段大小集中在300～2000 bp，重組率為91.67%。以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌與cDNA文庫酵母菌進行雙雜交，陽性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba（SD/-4/X/A）固體培養基上長出菌落且明顯變藍，測序結果顯示共篩選出4個能與σA蛋白相互作用的宿主蛋白，分別是初期多肽相關復合體α亞基（NACA）、核苷二磷酸激酶2（NME2）、假定蛋白及線粒體核糖體蛋白S9（MRPS9）。【結論】通過SMART技術構建的CEF細胞cDNA文庫具有較好的庫容和滴度，且從cDNA文庫中篩選出4種與ARV σA蛋白相互作用的宿主蛋白，為后續研究互作蛋白對ARV復制及凋亡的分子調控機制提供了可靠數據。

關鍵詞： 禽呼腸孤病毒;σA蛋白;cDNA文庫;互作蛋白;酵母雙雜交

中圖分類號： S852.657? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）06-1362-07

Abstract：【Objective】Construction of a cDNA library of chicken embryo fibroblasts（CEF） and screening for host proteins interacting with avian reovirus σA protein were conducted to lay a foundation for revealing the molecular regulation mechanism of interaction protein on ARV replication and apoptosis. 【Method】Extraction of CEF total RNA using TRIzol method was carried out， and double-strands cDNA（ds cDNA） was synthesized by SMART and LD-PCR technique. Co-transformation of ds cDNA with linearized pGADT7-Rec in competent Y187 yeast cells was realized， then cDNA library was established. The bait plasmid pGBKT7-σA was transformed into Y2HGold yeast competent cells，and yeast two-hybrid screening was conducted with the established cDNA library. The selected candidate library strain was extracted by plasmid， then co-transformed with bait plasmid pGBKT7-σAinto Y2HGold yeast cells. The colonies that grew well and could turn blue in solid media containing SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba were selected，then blue yeast plasmid was extracted for sequencing analysis. 【Result】The capacity of CEF cell cDNA library was 1.6×106 CFU， titer was 3.1×108 CFU/mL，the insert size was between 300 bp and 2000 bp， recombination rate was about 91.67%. Two-hybridization was carried out with Y2HGold yeast strain containing pGBKT7-σA and cDNA library yeast strain， and the po-sitive clone was able to grow colonieson the SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba（SD/-4/X/A） solid media and appeared blue. The sequencing results showed that four host proteins interacting with σA protein were screened， which were the initial polypeptide-related complex α subunit（NACA）， nucleoside diphosphate kinase 2（NME2）， putative protein and mitochondrial ribosomal protein S9（MRPS9）， respectively. 【Conclusion】The constructed CEF cDNA library by SMART technique has a good capacity and titer， and four host proteins interacting with ARV σA protein are screened from the cDNA library for further study of the molecular mechanisms interacting with ARV replication and apoptosis.

Key words： avian reovirus; σA protein; cDNA library; interacting proteion; yeast two-hybrid

收稿日期：2018-06-29

作者簡介：*為通訊作者，謝芝勛（1963-），研究員，主要從事動物傳染病防控技術研究工作，E-mail：xiezhixun@126.com。葉麗娜（1989-），主要從事動物傳染病分子生物學研究工作，E-mail：931997686@qq.com

0 引言

【研究意義】禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）是家禽中普遍存在且具有免疫抑制作用的一種病毒，主要引起雞病毒性關節炎、矮小綜合征和呼吸道疾病等（韋平和秦愛建，2008;謝志勤等，2012），導致感染后的雛雞免疫器官發育不良（張昆麗等，2015a，2015b），對養禽業危害嚴重。σA蛋白為ARV的結構蛋白，主要構成其核衣殼，與病毒拮抗干擾素作用有關（González-López et al.，2003），通過降低感染雞群的免疫應答能力而引起免疫抑制。σA蛋白還能激活PI3K/Akt信號通路，有利于ARV在宿主細胞內感染復制（謝麗基等，2015）。此外，Yin等（2002）研究發現σA蛋白可將4種三磷酸核苷（NTP）水解成二磷酸核苷（NDP）或核苷酸（NMP）及游離磷酸，為病毒的復制和轉錄提供能量;Chiu等（2016）研究發現σA蛋白能進入宿主細胞核內，與細胞核內蛋白發生結合;但至今尚未明確σA蛋白是與宿主細胞中的何種蛋白發生相互作用而最終誘導一系列生物學下游反應。鑒于雞胚成纖維細胞（Chicken embryo fibroblasts，CEF）對ARV的易感性，且易于制備，通常將CEF細胞作為研究ARV的細胞模型（張昆麗等，2015a，2015b），因此，以CEF細胞為宿主細胞模型構建cDNA文庫，并篩選與σA蛋白相互作用的宿主蛋白，對揭示σA蛋白的作用機理具有重要意義。【前人研究進展】CEF細胞來源方便、制備簡單，且表面有許多病毒受體，使其可成為很多病毒的體外宿主細胞，如研究馬立克氏病毒（MDV）、雞傳染性法氏囊病毒（IBDV）和雞新城疫病毒（NDV）等常見動物病毒時均首選CEF細胞作為宿主細胞（王友等，2013）。劉偉等（2007）運用Gateway技術對CEF細胞mRNA進行分離純化并反轉錄后連接Adapter，經BP重組反應及LR重組反應后成功構建獲得CEF細胞表達文庫，文庫庫容為5.5×106 CFU，文庫滴度為5×105 CFU/mL，為下一步研究IBDV致病機制打下基礎。張改平等（2008）也成功構建了CEF細胞cDNA文庫，其庫容為8.8×105 CFU，可用于CEF細胞相關功能蛋白的研究。趙緒永等（2008）成功構建了CEF細胞的cDNA T7噬菌體表達文庫，為篩選和研究CEF細胞上的病毒受體分子奠定了基礎。段志強等（2011）運用SMART技術和LD-PCR將CEF細胞總RNA反轉錄合成雙鏈cDNA（ds cDNA）后轉化AH109酵母感受態細胞，成功構建獲得CEF細胞的cDNA文庫，文庫庫容為3×106 CFU。祁小樂等（2013）運用SMART技術成功構建了CEF細胞cDNA文庫，文庫滴度為6.94×107 CFU/mL，并證實該cDNA文庫可用于研究IBDV和NDV等禽病病毒與宿主蛋白的相互作用。此外，王建琳等（2017）利用CEF細胞研究NDV誘導雞TLR和Mx基因mRNA轉錄水平，以期為揭示不同毒力NDV誘導IFN-I產生差異的作用機制提供參考依據;劉煒瑋（2018）利用CEF細胞研究了NDV的復制機制及其與宿主的相互作用;王靜等（2018）利用CEF細胞揭示禽網狀內皮組織增生癥病毒（REV）感染宿主的致瘤及免疫抑制機制。【本研究切入點】CEF細胞是研究病原體蛋白與宿主蛋白相互作用的首選宿主細胞，在NDV、IBDV等禽病病毒上已取得成功（李鐵強，2008;朱禮倩，2008;劉煒瑋，2018），但目前鮮見利用CEF細胞篩選與ARV σA蛋白相互作用宿主蛋白的研究報道。【擬解決的關鍵問題】通過SMART技術構建CEF細胞cDNA文庫，并采用酵母雙雜交技術篩選出與ARV σA相互作用的宿主蛋白，為揭示互作蛋白對ARV復制及凋亡的分子調控機制打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

10日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司;氨芐青霉素（Amp+）、RNA提取試劑盒RNAiso Plus、Premix Ex Taq和RNA Loading Bu-ffer購自TaKaRa公司;質粒提取試劑盒購自美國Axygen公司;cDNA文庫構建試劑盒、酵母菌質粒提取試劑盒、Aureobasidin A（Aba）、X-α-gal及SD/Trp、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His（SD/-4）等各種酵母培養基購自Clontech公司，其中Y187、Y2HGold、pGADT7-Rec和Carrier DNA為文庫構建試劑盒自帶;參照盧恒等（2017）的方法構建pGBKTA-σA誘餌質粒;cDNA文庫鑒定引物T7（5'-TAATACGACTCA CTATAGGGC-3'）和3'AD（5'-AGATGGTGCACGAT GCACAG-3'）由深圳華大基因股份有限公司合成。

1. 2 CEF細胞制備

取10日齡SPF雞胚按常規方法制備CEF細胞（韋平和秦愛建，2008），置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養21 h后提取細胞總RNA。

1. 3 CEF細胞總RNA提取及cDNA第一鏈合成

按照RNAiso Plus試劑盒說明提取細胞總RNA，然后用40.0 μL無RNA酶水溶解，紫外分光光度計測定總RNA濃度及OD260/OD280，取5.0 μL RNA并加入等體積RNA Loading Buffer，65 ℃作用10 min后以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測分析。按照cDNA文庫構建試劑盒說明合成cDNA第一鏈。

1. 4 ds cDNA擴增及純化

采用LD-PCR將cDNA第一鏈合成ds cDNA，反應體系和擴增程序按照試劑盒說明進行操作，選擇擴增24個循環。擴增結束后取7.0 μL LD-PCR產物，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，剩余LD-PCR產物經CHROMA SPIN TE-400柱進行純化。

1. 5 Y187酵母感受態細胞制備

挑取30 ℃培養3 d的Y187酵母單菌落，接種于20.0 mL的YPDA液體培養基中，30 ℃振蕩培養至OD600>1.5（約24 h），取菌液接種至100.0 mL新的YPDA液體培養基中，使菌液OD600為0.2～0.3，繼續培養至OD600為0.4～0.6（4～5 h）。取100.0 mL菌液700×g離心5 min后用30.0 mL無菌去離子水重懸，700×g再離心5 min，用1.5 mL 1.1×TE/LiAC重懸菌體，12000 r/min離心15 s，再用600.0 μL 1.1×TE/LiAC重懸菌體，此菌體即為Y187酵母感受態細胞。

1. 6 ds cDNA和pGADT7-Rec共轉化Y187酵母菌

取3 μg ds cDNA、6.0 μL pGADT7-Rec（0.5 μg/ μL）和20.0 μL Carrier DNA（經熱變性處理），混均后加入到600.0 μL冰浴的Y187酵母感受態細胞中，用15.0 mL 0.9% NaCl重懸菌體。取少量菌液，分別按1∶10和1∶100倍稀釋，兩個稀釋度的菌液各取100.0 μL涂布于100 mm的SD/-Leu培養基上，用于計算cDNA文庫庫容。剩余菌液涂布于100個150 mm的SD/-Leu培養基上，30 ℃培養3～5 d。

1. 7 文庫收集及滴度測定

將1.6中長出菌落的SD/-Leu培養基置于4 ℃冰箱中預冷4 h，用凍存液（含25%甘油的YPDA）和玻璃珠將培養基上的菌落洗下并收集，離心后將細菌濃度調至大于2×107 CFU/mL。取少量cDNA文庫進行102、104和106倍稀釋，取100.0 μL稀釋后的菌液分別涂布于100 mm SD/-Leu培養基上，30 ℃培養3 d后進行菌落計數并計算文庫滴度。文庫滴度（CFU/mL）=培養基菌落數/（涂板體積×稀釋倍數）。

1. 8 文庫插入片段鑒定

在SD/-Leu培養基上隨機挑取24個單菌落，加200.0 μL PBS懸浮菌體，水浴鍋中煮沸10 min后進行菌落PCR鑒定。采用pGADT7-Rec序列上的T7和3'AD引物擴增目的片段，PCR反應體系：Premix Ex Taq 12.5 μL，T7和3'AD引物（10 μmol/L）各1.0 μL，菌液1.0 μL，無菌去離子水9.5 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行34個循環;72 ℃延伸5 min。PCR產物以1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，鑒定文庫插入片段大小。

1. 9 誘餌菌株與文庫雜交

將pGBKTA-σA誘餌質粒轉至Y2HGold酵母感受態細胞中，涂布在SD/-Trp固體培養基上，30 ℃培養3 d后參照羅維玉等（2016）的方法進行酵母雙雜交，挑選SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba（SD/-4/X/A）固體培養基上的藍色菌落，并接種至SD/-Trp/-Leu（SD/-2）固體培養基上，培養3 d后按照酵母菌質粒提取試劑盒說明提取質粒。

1. 10 酵母質粒提取及回轉驗證

以1.9中提取獲得的候選文庫質粒轉化DH5α感受態細胞，涂布于含100 ng/μL Amp+的LB培養基上，再挑取單菌落接種至含100 ng/μL Amp+的LB液體培養基中培養，提取質粒并與pGBKT7-σA誘餌質粒（各500 ng）共轉化Y2HGold酵母感受態細胞，以pGBKT7-53和pGADT7-T共轉化作為陽性對照，pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉化作為陰性對照，涂布于SD/-4/X/A培養基上，30 ℃培養3 d，觀察酵母菌的生長情況。當SD/-4/X/A培養基上長出菌落且明顯變藍時判為陽性，否則判為陰性。陽性候選酵母菌質粒送至深圳華大基因股份有限公司測序，測序結果在NCBI上進行BLAST比對分析。

2 結果與分析

2. 1 CEF細胞總RNA提取效果

提取的CEF細胞總RNA經紫外分光光度計測定，OD260/OD280為2.01，濃度為240 ng/μL，表明提取的總RNA純度較高。1.0%瓊脂糖凝膠電泳結果（圖1）顯示，CEF細胞總RNA富含兩條特異性條帶（28S和18S），小片段5S條帶也清晰可見。其中，28S∶18S約2∶1，表明提取的總RNA未發生降解，質量良好，可用于后續的cDNA文庫構建。

2. 2 ds cDNA合成與純化結果

LD-PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖2）顯示合成的ds cDNA呈彌散狀分布，表明不同豐度的mRNA均得到擴增。純化后的ds cDNA經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖3）發現ds cDNA小片段大部分被去除，片段大小主要集中在500～2000 bp，即合成的ds cDNA片段長度適用于cDNA文庫構建。

2. 3 文庫庫容及滴度測定結果

以ds cDNA和pGADT7-Rec共轉化的Y187酵母菌液經1∶100倍稀釋培養3 d后，SD/-Leu培養基上有109個單菌落，文庫庫容1.6×106 CFU。收獲的cDNA文庫按102、104和106倍進行稀釋，30 ℃培養3 d后發現106倍稀釋的培養基上有31個單菌落（圖4），計算得到該文庫滴度為3.1×108 CFU/mL。

2. 4 cDNA文庫插入片段鑒定結果

隨機挑取24個單菌落進行PCR鑒定，結果（圖5）顯示，擴增片段大小集中在300～2000 bp。24個克隆（單菌落）中僅有2個克隆未擴增出目的條帶，重組率為91.67%，表明構建的cDNA文庫質量較好，可用于后續的酵母雙雜交試驗。

2. 5 酵母菌回轉驗證試驗結果

以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌與cDNA文庫酵母菌進行雙雜交，然后篩選SD-/Trp/-Leu/- Ade/-His/X-α-Gal/Aba（SD/-4/X/A）固體培養基上的藍色菌落進行回轉驗證試驗，回轉驗證結果如圖6所示。陽性對照和陽性克隆均長出菌落且明顯變藍，而陰性對照未長出菌落。

2. 6 與σA蛋白相互作用的陽性克隆測序結果

將陽性克隆質粒送至深圳華大基因股份有限公司測序，測序結果在NCBI上進行BLAST比對分析，結果得到4個與σA蛋白相互作用蛋白的編碼基因，對應的編碼蛋白（表1）分別為初期多肽相關復合體α亞基（NACA）、核苷二磷酸激酶2（NME2）、假定蛋白及線粒體核糖體蛋白S9（MRPS9）。

3 討論

cDNA文庫最早由Hofstetter于1976年成功構建獲得，最傳統的方法是將反轉錄擴增獲得的cDNA酶切后與雙酶切的質粒載體連接，但這種方法存在連接效率低、難以擴增、文庫cDNA片段較小等缺點（晏慧君等，2006）。近年來，cDNA文庫構建技術在不斷完善，最常用技術是美國Clontech公司的SMART技術及美國Invitrogen公司的GeneRace試劑盒。酵母雙雜交技術目前已廣泛應用于蛋白相互作用的研究領域，尤其是病原體蛋白與宿主蛋白相互作用方面，為揭示動物病原分子致病機制、篩選疾病分子標志物和藥物靶位、研發新藥和疫苗提供了技術保障（譚偉等，2014）。美國Clontech公司研發的Matchmaker雙雜交系統不僅提供構建全長cNDA文庫的SMART技術，還提供構建cDNA文庫、評判cDNA文庫質量標準等一系列詳細的技術服務。本研究將ds cDNA與pGADT7-Rec表達載體通過同源重組直接連接后共轉化Y187酵母感受態細胞，與傳統方法將cDNA和載體酶切后連接再轉入細胞中的繁瑣步驟相比，該方法更快速簡便。在利用美國Clontech公司SMART技術構建CEF細胞cDNA文庫的過程中，細胞RNA的質量決定了cDNA文庫質量。用于cDNA合成的RNA既可是總RNA也可是mRNA，本研究選擇總RNA合成cDNA第一鏈，減少了RNA在純化過程中的降解（28S∶18S約2∶1），有效保證了cDNA文庫的完整性，構建的CEF細胞cDNA文庫庫容為1.6×106 CFU（大于最低要求的1.0×106 CFU），文庫滴度為3.1×108 CFU/mL（大于最低要求的2.0×107 CFU/mL），文庫插入片段大小主要集中在300～2000 bp，均滿足酵母雙雜交試驗建庫要求。

將成功構建的cDNA文庫與pGBKT7-σA誘餌質粒進行酵母雙雜交，共篩選出4種互作蛋白，分別為初期多肽相關復合體α亞基（NACA）、核苷二磷酸激酶2（NME2）、假定蛋白及線粒體核糖體蛋白S9（MRPS9）。初期多肽相關復合體（NAC）是新生肽鏈從核糖體上延伸出來第一個接觸的胞質因子，由α和β兩個亞基組成，其中NACA主要在轉錄調控過程中發揮作用，包括激活骨鈣素基因、與輔激活類蛋白相互作用、調控FADD（一種死亡結構域蛋白）等一系列功能，且在病毒性疾病中NACA能通過與病毒蛋白相互作用，導致機體功能紊亂（劉嬌玲等，2015）。核苷二磷酸激酶（NDPK）可調節細胞增殖、分化、發育和凋亡，還參與細胞的內吞（熊盛等，2006）。假定蛋白是一種功能尚未明確的蛋白，其功能有待進一步研究。核糖體蛋白S9（RPS9）廣泛存在于酵母菌、細菌、寄生蟲和哺乳動物的細胞中，Kim等（2003）研究證實RPS9與細胞凋亡相關，Lindstr?m和Nistér（2010）也研究發現RPS9能激活p53通路，而p53通路與細胞凋亡有關。本研究采用酵母雙雜交技術從構建的CEF細胞cDNA文庫中篩選出4種與ARV σA蛋白相互作用的宿主蛋白，可為后期研究互作蛋白對ARV復制及凋亡的分子調控機制打下基礎。

4 結論

通過SMART技術構建的CEF細胞cDNA文庫具有較好的庫容和滴度，且從cDNA文庫中篩選出4種與ARV σA相互作用的宿主蛋白，為后續研究互作蛋白對ARV復制及凋亡的分子調控機制提供了可靠數據。

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（責任編輯 蘭宗寶）