探討間接免疫熒光法檢測呼吸道病毒九聯檢的影響因素

馮艷鵬 皮敏

關鍵詞：間接免疫熒光;呼吸道病毒;影響因素

呼吸道感染有70%-80%由病毒引起的，包括腺病毒，冠狀病毒，腺病毒，流感病毒和副流感病毒，呼吸道合胞病毒?？刹《竞涂滤_奇病毒。另有20%-30%的呼吸道感染是由細菌引起的如：流感嗜血桿菌，嗜肺軍團菌，肺炎鏈球菌，葡萄球菌等【1-1】。還有肺炎支原體，肺炎衣原體，立克次體，真菌等引起的感染。感染病原體種類多，不僅是單一病原體感染，還有混合多種病原體感染，病原體多種耐藥，給疾病的診斷和治療增加了難度。因此呼吸道病原體的及時檢測，對查出病原體診斷呼吸道感染性疾病具有重要意義。

檢測呼吸道病原體的方法很多，例如細菌及真菌的培養及藥敏，酶聯免疫吸附試驗，分子生物學等。細菌及真菌取決于標本的采樣，病原體的營養條件，生存環境，培養周期長，定植還是污染難以區分，檢測繁瑣等難以滿足臨床需要。一次…簡便快速檢測出多種病原體的實驗技術能夠為臨床醫生的診斷提供很大的幫助。如鄭州安圖公司的呼吸道病毒九聯檢試劑采用間接免疫熒光法，引用進口技術可在一張玻片上同時檢測嗜肺軍團菌，肺炎支原體，肺炎衣原體，Q熱立克次體，呼吸道合胞病毒，腺病毒，甲型流感病毒，乙型流感病毒，副流感病毒九種病原體，檢測采樣簡單，操作容易，準確可靠為臨床的診治提供有效的依據。呼吸道病毒九聯檢的檢測包括標本的采集，標本和試劑的平衡，加樣溫浴洗滌，晾片，封閉，閱片，結果判讀每個環節都至關重要，任何操作不當都會影響結果的判讀主要有以下影響因素：

1 標本的采集? 采集合格的標本是保證質量的前提。因為標本采集的是血清含有IgG和IgM，需要分離IgG，樣本乳糜溶血等，樣本量過少會無法完成檢測，帶入沉淀會假陽性，過多會影響結果判讀的背景。加入吸附劑需要充分振蕩混勻，離心沉淀13000轉/分鐘，離心10分鐘。上清液中盡量不含有IgG.

2 試劑平衡，溫浴，加樣 試劑與標本從冰箱取出后需要在室溫平衡30分鐘后再操作。溫浴第一次是抗原抗體的結合37℃90分鐘，水浴箱的溫度要及時檢測，保證檢測結果的準確。 加樣時需加入檢測孔內，不能觸及底部，更不能溢出，加樣槍及時校準。

3 洗滌? 洗滌是檢測中最關鍵的一個環節，用磷酸鹽緩沖液沖洗時注意掌握力度，操作生不能直接對著檢測孔沖洗以免造成假陰性。放入洗盒后置水平搖床10分鐘，手工振蕩時頻率不能太快，以免洗掉反應物造成假陰性。

4 晾干玻片時采用自然風干，不能用熱的吹風機吹，導致反應物變性。

5 加封閉介質，加太少導致視野不清楚。太多會溢出玻片影響閱片

6 鏡檢 玻片制備完畢后避光，熒光劑會見光分解變弱。鏡檢集中閱片，最好在1小時內看完，時間過長熒光會變弱或消失，導致假陰性。如果不能及時閱片請放入2-8℃冰箱避光保存，24小時內看完。

7 結果判讀：第10孔是對照孔，洗滌背景的好壞都取決于這一孔，當然不排除抗核抗體陽性標本的干擾，嗜肺軍團菌，肺炎衣原體，Q熱立克次體是黑色背景，需要熒光顯微鏡的亮度要足夠，仔細觀察成桿狀，點狀，球桿狀黃綠色熒光。肺炎支原體需要視野下50%視野整個細胞都有黃綠色熒光才是陽性。甲型流感病毒，乙型流感病毒，副流感病毒存在相同的基因可能會有第7.8.9孔同時陽性，察每個視野3-5個細胞熒光強度強者才是陽性。還有存在加完熒光劑沉積在檢測孔邊緣，會導致邊緣效應，一定要縱觀全片綜合判斷。

總之，間接免疫熒光法檢測呼吸道病毒九聯檢，操作簡單，靈敏度高，特異性好，為臨床治療呼吸道感染提供可靠的依據。操作過程中重視檢驗前，檢驗中，檢驗后的質量控制注重每一個環節，才能保證檢驗結果的準確。

參考文獻：

[1]王輝，任健康，王明貴 .臨床微生物學檢驗[M].人民衛生出版社.2015：49.

[2]陳華根 .間接免疫熒光法檢測呼吸道病原體質量控制[J].檢驗醫學與臨床2014，11（21）：3086-3087.