Daxx基因在小鼠睪丸精子發生過程中的表達分析

周生輝

[摘要]目的：分析Daxx基因在小鼠睪丸精子發生過程中的表達。方法：對不同周齡的野生小鼠的睪丸組織、成年睪丸支持細胞的雄激素受體特異性敲除（SCARKO）以及其雄性激素受體的敲除（ARKO）小鼠睪丸的水平進行檢測分析。結果：SCARKO小鼠和野生型的小鼠相比較其睪丸中Daxx基因的表達沒有明顯不同，然而在生精細胞的細胞核當中呈現極性分布的情況，在ARKO小鼠的睪丸Daxx基因的表達與其他方法相比明顯降低。結論：ARKO的小鼠與野生型小鼠相比其Daxx基因的表達明顯降低，Daxx基因的定位情況受到睪丸支持細胞中AR基因的特異性敲除的作用。小鼠睪丸精子的發生過程可能有Daxx基因的參與。

[關鍵詞]Daxx基因;實驗小鼠;睪丸;精子

[中圖分類號]R321 [文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2019）21-0011-02

在精子的發生過程中雄激素以及受體（AR）有及其重要的影響Ⅲ。精子不能正常發揮作用以及男性造成的不育狀況與雄激素的低水平或AR基因突變情況有直接關系，睪丸的組織不相同細胞類型的條件性AR基因敲除以至于小鼠呈現各種情況的生精障礙。睪丸支持細胞中的AR調節精子的發生受到雄激素作用的影響。相關研究人員通過使用二代測序的方法，對SCARKO小鼠和野生型的小鼠睪丸的表達進行詳細的對比，結果發現存在一系列的基因差異表達情況。對于AR敲除后的死亡結構域的相關蛋白其表達顯著降低。Daxx基因最終能夠進入細胞核，而后進入細胞質最終使細胞凋亡。Daxx蛋白表現出來的高表達情況說明其影響睪丸的生精作用，值得對睪丸生理方面的深入探究。

1資料和方法

1.1材料的準備準備1、2、3、4、6、8周的野生型小鼠各4只，經處死后將其睪丸的總RNA提取出來。8周的小鼠、ARKO和SCARKO小鼠各準備4只，取其膀胱、脾、心、腎、肝、肺、腦、睪丸、附睪的總RNA和總蛋白，將睪丸組織進行固定。

1.2提取反轉錄PCtL采用0.8%的瓊脂糖電泳檢驗RNA完整程度。將RNA進行定量操作后取1ug并參照說明進行反轉錄操作。將Cdna提取后進行PCR反應，反應體系包括10uL的PCR、8uL的雙蒸水、1uL的Cdna以及各0.5uL的引物，總為20uL。PCR擴增在98℃兩min的預變性，98℃的10s鐘的變性，60℃的30s退火，72℃的20s的延伸總計為35個循環過程，在72℃下延伸5min，在4℃下進行冷卻，對擴增產物的檢驗采用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗。

1.3通過熒光定量儀對qPCR進行檢驗反應體系中有10uL的TaqⅡPCR，1uL的cDNA，8uL的DEPC H20，0.5uL的上下游引物。在95℃下30s，95℃下5s，60℃下30s，72℃下15s，一共為40個循環過程。內參為GAPDH。

1.4Western印跡蛋白質的濃度大小通過BCA方法進行測定，將濃度定為1微克/uL，將5倍的上樣緩沖液加入其中，在98℃下進行5min。然后通過常規電泳、轉膜和5%的脫脂牛奶進行封閉處理，將一抗加入經過一夜。采用TBST清洗重復3次，每次清洗5min，將二抗加入進行1小時的室溫培育，清洗方法同上，ECL發光液體在培育后曝光。室溫保存直至晾干然后掃描獲取結果。

1.5免疫組化以及細胞免疫熒光染色將石蠟包裹的睪丸組織切成厚度為3微米的片狀，并干燥后備用。一次經過二甲苯、乙醇水、枸櫞酸處理，冷卻達到室溫，采用4%多聚甲醛固定細胞，0.1%的Trion x-100進行十min的打孔操作。精原細胞爬片之后，清洗并固定，將切片或爬片在室溫下封閉保存1小時，一抗在4℃下經過一晚，1gG熒光二抗在室溫下培育兩小時，染核后用熒光防猝滅劑封閉樣品片，觀察熒光狀態。采用1gG代替一抗進行陰性比較。

1.6培養細胞在5%的二氧化碳，溫度為37℃的條件下培養。

1.7統計學方法用SPSS20.0對實驗的所有數據進行統計分析，計量資料（x±s）表示，通過t檢驗進行組間比較，使用計數數據病例數（n，%），并進行x檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1不同周齡的野生型小鼠其Daxx基因在睪丸中的表達2周的小鼠Daxx基因表達處于較低水平，3周的小鼠表達升高，mRNA在其性成熟時表達水平為最高。2周的小鼠其蛋白水平表達較低，與mRNA相類似。4周達到最高，6、8周開始降低，但相差不顯著。

2.2AR.KO、SCARKO小鼠與野生小鼠睪丸中Daxx基因的表達情況對比SCARKO小鼠的睪丸中mRNA與蛋白的表達水平與野生小鼠相比沒有明顯的不同，ARKO的小鼠mRNA與蛋白的水平明顯下降。

2.3Daxx在1周和2周的熒光強度比較弱，到3周增強，4周表現最強，6、8周的熒光強度與4周相比沒有明顯不同。4周的生精細胞經研究表現出核極性的表達。

2.4野生型成年小鼠的Daxx的熒光強度集中于細胞核，SCARKO小鼠的熒光強度比較強，表現出細胞核極性表達情況，ARKO小鼠的熒光強度比較弱，定位無法確定。

2.5Daxx表現于精原細胞的細胞核部位。

3討論

SCARKO和ARKO的生精過程分別在精母細胞減數分裂的細線期和粗線期停止，特異性AR敲除小鼠與野生型小鼠沒有顯著的不同。支持細胞中AR基因的特異性敲除和全身性的AR基因敲除有相似的阻礙精子發生的情況，精子發生也與支持細胞有重要關系。AR的主要表達部位為睪丸的支持細胞、間質細胞、血管壁以及肌樣細胞。有專家發現SCARKO與野生型小鼠的睪丸在Daxx表達上有顯著差異。這一系列研究為精子被阻礙造成男性不育提供臨床診療根據。

在本次研究過程中，2、3周的小鼠Daxx基因的表達從較低變為升高，4周的小鼠為最高，6，8周的小鼠又開始下降，但與4周的相比沒有明顯的不同。SCARKO小鼠的睪丸中mRNA與蛋白的表達水平與野生小鼠相比沒有明顯的不同，ARKO的小鼠mRNA與蛋白的水平明顯下降。Daxx在1周和2周的熒光強度比較弱，到3周增強，4周表現最強，6、8周的熒光強度與4周相比沒有明顯不同。野生型成年小鼠的Daxx的熒光強度集中于細胞核，SCARKO小鼠的熒光強度比較強，表現出細胞核極性表達情況，ARKO小鼠的熒光強度比較弱，定位無法確定。Daxx表現于精原細胞的細胞核部位。

綜上所述，本次研究探究了Daxx基因在小鼠睪丸精子發生過程中的表達特點，發現小鼠睪丸精子的發生過程存在Daxx蛋白的調節和控制的參與，并深入觀察了Daxx的作用，為臨床上治療男性不育癥狀提供診療依據。